產(chǎn)品描述

Cyanine 3（Cy3），是花青素熒光素染料家族的成員之一，是化學合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以兩種異構體的形式供貨，一種是非磺化花青素（non-sulfonated cyanines），一種是磺化花青素（sulfonated cyanine）。兩者的光譜性質幾乎一致，因此大部分應用可相互替換，比如，都可用于標記DNA或蛋白等生物分子。兩者的主要區(qū)別在于：磺化染料是水溶性的，在水相的標記反應體系內不需要使用有機共溶劑，并且降低染料在水中聚集的可能性，增強標記效率。

本Cyanine 3（Cy3）是以磺化染料的形式供貨，易溶于水，Ex=555 nm，Em=565 nm，具有明亮熒光，光穩(wěn)定性強，pH非敏感性等優(yōu)點，適用于標記多肽、蛋白以及核酸等生物分子，以通過后續(xù)熒光成像以及其他熒光生物學方法分析目的蛋白。

本Cy3 NHS ester，即含N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide）活化基團的Cy3，可直接與生化分子上的氨基（-NH2）反應形成穩(wěn)定的酰胺鍵，主要是伯胺。

產(chǎn)品性質

英文別名（English Synonym）	Cyanine 3, monosuccinimidyl ester
分子量（Molecular Weight）	829.03
外觀（Appearance）	紫色固體
Ex/Em	555nm/565nm
溶解性（Solubility）	溶于DMSO，DMF，水
結構式（Structure）

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃干燥避光保存，有效期1年。

注意事項

1）NHS ester基團對濕度非常敏感，務必干燥保存產(chǎn)品。使用前產(chǎn)品需放到室溫回溫至少20min。

2）NHS ester基團的水解發(fā)生在水溶性緩沖體系屬于競爭性反應。對蛋白/多肽（濃度：1-1mg/ml）伯胺的連接反應建議在pH 7-9范圍內進行。使用不含氨基的緩沖體系，pH 7-9。比如100 mM 磷酸鈉，150 mM 氯化鈉， pH 7.5； 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸鈉/碳酸氫鈉, pH 8-9；或100mM 硼酸緩沖液, pH 8-9。

3）不要使用含伯胺的任何緩沖液，比如Tris，甘氨酸。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5) 本產(chǎn)品僅作科研用途!

 

使用方法（用Cy3-NHS Ester 標記抗體）

注意：可參考本方法進行多肽，蛋白或者其他分子的標記，需要根據(jù)具體的實驗體系對合適的標記緩沖體系，樣本濃度，染料濃度等參數(shù)做出合適的調整。

1）用不含氨基的合適的緩沖液（eg.100mM磷酸鈉，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗體使其濃度達到1-5mg/mL?！咀ⅰ浚喝缈贵w中有殘留Tris或 glycine 污染，則需透析或者脫鹽到合適的緩沖液內。

2）使用前，用適量去離子水或者無水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩爾濃度為抗體摩爾濃度的400倍，例如，待標記的IgG濃度為1mg/mL（eg 6.7µM），則溶解后Cy3-NHS的濃度為2.7mM；如待標記的IgG濃度為2.5mg/mL，則溶解后Cy3-NHS的濃度為6.75mM；

3）向抗體中加入適量Cy3-NHS試劑，以達到預期的標記效率?！咀ⅰ浚寒斢肅y 3 NHS ester標記抗體或其他蛋白，亮度最高的偶聯(lián)物其染料/蛋白的比率為4-12，取決于特定的應用。過高比率會增加非特異性背景，喪失抗體特異性結合，導致聚集。建議根據(jù)應用優(yōu)化標記比率。

4）室溫孵育60min（或更長）；

5）利用合適緩沖液透析或脫鹽柱去除未反應的試劑；

6）分別在280nm和550nm檢測Cy3-抗體的吸光值；

7）測定Cy3標記效率（DOL）和標記濃度。見下公式。

公式一. 利用下面公式計算Cy3標記效率（DOL）及其濃度（mg/ml）

Eq.1    Number of Cy3 dye per protein=molarity Cy3 dye / molarity protein

Eq.2    [Molarity of Cy3 dye]=A555/ε555

Eq.3    [Molarity of protein]=A280C/ε280

Eq.4    mg/ml=[A280-(A555×0.08)/(E1%/10)]×dilution   factor

【注】上述參數(shù)如下： A555=conjugate absorbance at   555±2nm ε555=molarextinction coefficient   Cys dye =150000M-1cm-1 A280= conjugate absorbance at   280nm A280C =corrected conjugate   absorbance at 280nm= A280-( A555×0.08) ε280= molarextinction coefficient   protein(M-1cm-1)=MWp×E1%/10

應用舉例

用高于抗體摩爾濃度20倍的Cy3-NHS標記 0.1 mL山羊IgG（濃度為1mg/mL）。標記后脫鹽去除未標記染料，在PBS中測定(1:5稀釋)測定其A280和A555:

A280=0.2906 

A555=0.9825

另：山羊IgG分子量為150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1

計算DOL如下：

By Equation 2      Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM

By Equation 3      Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM

By Equation 1      number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3

則計算Cy3-IgG protein 濃度為（mg/mL）：

By Equation 4     mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL

 

HB180710