產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品描述
目前常用的細胞增殖標記物有4種，DNA聚合酶α（DNA polymerase α），增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA），Ki-67和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）。其中Brdu為組織細胞非內(nèi)源性表達存在，應(yīng)用相對較廣。Brdu，也稱為溴化去氧尿苷，一種合成的胸苷類似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合到細胞DNA中。從而檢測細胞DNA合成和標記細胞分裂，凋亡等行為。在遺傳研究中Brdu可通過活體注射或細胞培養(yǎng)加載，然后使用抗Brdu的單克隆抗體進行特異性標記，ICC或IHC法染色法顯示增殖細胞。另外，還能同時結(jié)合其它細胞標記物，雙重染色，來判斷增殖細胞的種類，增殖速度等，對研究細胞動力學有著重要意義。
產(chǎn)品性質(zhì)
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中文別名（Chinese Synonym） |
5-溴-1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖)尿嘧啶；5-溴脫氧尿苷；溴化去氧尿苷； |
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英文別名（English Synonym） |
Br-dU; BUdR; 5-BrdU; 5-Bromodeoxyuridine; |
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CAS號（CAS NO.） |
59-14-3 |
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分子式（Formula） |
C9H11BrN2O5 |
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分子量（Molecular Weight） |
307.10 |
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外觀（Appearance） |
白色或類白色粉末 |
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熔點（Melting Point） |
187-189℃ |
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純度（Purity, HPLC） |
≥99% |
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溶解性（Solubility） |
溶于1M 氫氧化銨（50 mg/mL），水（高達10 mg/mL）；溶于DMF，DMSO，水（加熱）（50-100 mg/mL） |
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結(jié)構(gòu)式（Structure） |
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運輸和保存方法
冰袋運輸。-25~-15℃干燥保存，有效期2年。
操作步驟
1. Brdu儲存液的準備用1X DPBS充分溶解適量的Brdu配置10 mg/mL的母液，過濾除菌后，按照0.5 mL/管的量分裝放在-20°C或者-80°C長期保存，避免反復(fù)凍融。Brdu儲存液再融化后，4°C可穩(wěn)定存放一周。
2. 體內(nèi)Brdu標記
1）腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/mL（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200 μL（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注意：最短在注射后0.5 h后在小腸，胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。而一般在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測到Brdu。這個時間可能對于一些快速分化的組織如小腸來說有些久。
2）根據(jù)自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續(xù)的IHC染色步驟。
3. 體外Brdu標記（培養(yǎng)原代細胞或者細胞系）
注：總的來說，10 μM Brdu（稀釋于培養(yǎng)液）是一個比較合適的方法用來標記不同物種來源的原代細胞或細胞系。當然，建議針對具體的實驗體系優(yōu)化方法。
1）在96孔板上按標準步驟進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為1-72 h；
2）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。37°C溫熱。
3）按100 μL/孔Brdu工作液的量進行細胞標記，37°C孵育60 min~過夜。同時設(shè)置非Brdu標記的細胞作為陰性對照。注意：最佳的孵育時間取決于細胞增殖速度以及需要達到的實驗?zāi)康?。比如，對于快速增殖細胞（?/font>HL-60）有效孵育時間為30-45 min；對于原代細胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細胞）孵育時間可能需要24 h。細胞密度最好不要超過2x106 cells/mL。
4）制備單細胞層玻片，使用以下任何一種方法：
a. 細胞離心涂片（cytospin）制備：使用細胞離心涂片機，將100 μL標記好的細胞（濃度為：1-2 x106 cells/mL）直接離心到干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上，風干。
b. 細胞涂片（cell-smear）制備：取一小滴標記好的細胞懸液于干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被玻片的一端，然后用第二個干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風干。
5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min（也可選擇4%多聚甲醛固定15min）。
6）PBS清洗細胞3次，每次5 min。
7）加入2M HCl中室溫孵育30 min-60min。注意：DNA的變性對于Brdu染色的成功至關(guān)重要。
8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5 min。
9）用0.1M Na2B4O7 （等體積步驟7）2M HCl的量）室溫浸泡15min，PBS浸洗玻片3次，每次10min （適當延長時間和加大體積，完全洗凈）；
10）吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
11）吸水紙吸掉封閉液，勿清洗，滴加足量稀釋好的一抗，并放入濕盒中，4℃孵育過夜；PBS清洗3次，每次5 min；
12）加入稀釋好的熒光二抗，濕盒室溫孵育1h；PBS清洗3次，每次5 min；
13）核復(fù)染：滴加DAPI，避光孵育5min-10min，PBS清洗3次，每次5 min；
14）用吸水紙吸干多余液體，用抗淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照
4. 體外Brdu標記（組織薄片）
1）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1 mM Brdu工作液。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37°C溫熱）完全浸泡組織。
2）用手術(shù)刀或者鋒利的刀片將組織切割成約1 mm厚，2 mm2大小的薄片。建議在溫熱的培養(yǎng)基內(nèi)進行切片，利于維持組織的活力。
3）轉(zhuǎn)移組織薄片至預(yù)裝有10 mL Brdu標記液的15 mL離心管內(nèi)。于37°，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育需要的時間。孵育時間可變，取決于組織薄片類型以及需要達到的實驗?zāi)康模ǔＳ玫臑?-4 h）。直接丟棄未用完的標記液。
4）37°C PBS清洗組織薄片，每次5 min。
5）使用標準的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）該品對肌體有不可逆損傷的可能性。使用時應(yīng)穿防護服和戴手套。應(yīng)避免吸入本品的粉塵。
3）本產(chǎn)品僅作科研用途！
HB230216
