MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒
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產(chǎn)品說明書
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），也稱作溴化噻唑藍(lán)四氮唑，是一種黃色染料，已經(jīng)普遍替代傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)染色法或者放射性同位素插入法，用來檢測(cè)細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖以及細(xì)胞毒性分析。檢測(cè)原理在于：MTT是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有細(xì)胞膜滲透性?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M(jìn)入的MTT還原成為水不溶性的深藍(lán)色MTT-甲臜結(jié)晶，而死細(xì)胞不具有此功能。甲臜結(jié)晶是不能穿透細(xì)胞膜，因此沉積在處于增殖且未受損傷的細(xì)胞內(nèi)。甲臜結(jié)晶可用DMSO或者酸化的異丙醇溶解出來，酶標(biāo)儀下測(cè)定570 nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，用以評(píng)估細(xì)胞存活狀況。
本試劑盒以MTT（高純度）作為指示劑，在經(jīng)典操作步驟的基礎(chǔ)上，采用獨(dú)特的甲臜溶解液配方，可以直接溶解甲臜沉淀，無需去除原有的培養(yǎng)液。從而避免因去除培養(yǎng)液時(shí)甲臜被部分去除而引起的操作誤差。具有本底低，靈敏度高，線性范圍寬，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。另外，本試劑盒還提供配套的一次性針頭過濾器和注射器，為實(shí)驗(yàn)帶來更多的便利。
產(chǎn)品組分
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編號(hào) |
組分 |
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 |
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40206ES76（500T） |
40206ES80（1000T） |
40206ES90（5000T） |
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40206-A |
MTT粉末 |
25 mg |
50 mg |
250 mg |
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40206-B |
MTT溶劑 |
5 mL |
10 mL |
50 mL |
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40206-C |
甲臜溶解液 |
50 mL |
100 mL |
100 mL×5 |
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40206-D |
除菌套裝 |
1包 |
1包 |
1包 |
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。
收到產(chǎn)品后，取出除菌套裝室溫保存，其他組分4℃保存。甲臜溶解液也可以放到室溫保存。一年有效。
注意事項(xiàng)
1）甲臜溶解液具有腐蝕性和毒性，使用時(shí)注意防護(hù)。
2）MTT有致癌性，應(yīng)小心操作；MTT溶液需要無菌，因其對(duì)菌很敏感。MTT溶液不可4℃保存超過1周，因其可能發(fā)生降解，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤。
3）MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內(nèi)。
4）使用微孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間比較長(zhǎng)，需要注意蒸發(fā)的問題。一般情況，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，建議棄用周圍一圈的方法，改加PBS，水或者細(xì)胞培養(yǎng)液等。也可通過將96孔板放在靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的位置，以減緩蒸發(fā)現(xiàn)象。
5）甲臜溶解液低溫或者常溫保存可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混勻后即可使用。
6）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
7）本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用方法（以96孔板為例）
細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件會(huì)影響檢測(cè)效果，因此進(jìn)行MTT檢測(cè)時(shí)需考慮這些條件，包括：培養(yǎng)時(shí)間，傳代次數(shù)以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分等。一般情況，48-72 h培養(yǎng)時(shí)間下，最初鋪板的細(xì)胞密度可控制在5×103~5×104/100 μL。也可根據(jù)細(xì)胞大小，增殖速度的快慢來優(yōu)化最初的細(xì)胞鋪板密度以及培養(yǎng)時(shí)間。
注意：1）最終檢測(cè)的培養(yǎng)液內(nèi)含有酚紅會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。推薦MTT檢測(cè)時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)在無酚紅環(huán)境下。也可以在進(jìn)行MTT孵育的時(shí)候改用無酚紅培養(yǎng)液。2）每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置空白對(duì)照孔（不含細(xì)胞）。對(duì)于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，還要設(shè)置未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞孔，此對(duì)照孔的吸光度范圍一般控制在0.75-1.25之間；每個(gè)樣品孔建議做三個(gè)平行。
A．實(shí)驗(yàn)前試劑準(zhǔn)備
1. MTT溶液
用5 mL MTT溶劑直接溶解25mg MTT粉末配制成5 mg/mL的工作液，用試劑盒內(nèi)提供的除菌套裝以除去溶液中的細(xì)菌，該溶液可4℃ 避光短時(shí)間保存（越短越好）。建議溶解后，直接將剩余液體小劑量分裝放到-20℃保存，避免反復(fù)凍融，6個(gè)月穩(wěn)定。
2） 甲臜溶解液（MTT終止液）
甲臜溶解液低溫或者常溫保存可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混勻后即可使用。
B．MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)
1）接種細(xì)胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔5×103~5×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 µL，培養(yǎng)板的邊緣孔用無菌PBS，水或者培養(yǎng)液填充。設(shè)置空白對(duì)照孔（不含有細(xì)胞）。
2）37℃，5% CO2，培養(yǎng)24-72 h。
3）可選：對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除舊的培養(yǎng)液，更換100 µL/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）；對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心96孔板，去除盡可能多的上清液。然后加入100 µL/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）重懸細(xì)胞；
4）每孔加入10 µL MTT工作液（5 mg/mL），加樣時(shí)盡量勤換槍頭，控制加量誤差。
5）水平搖床上低速混勻1 min后，放入37℃培養(yǎng)箱孵育4h。注：對(duì)于高密度的細(xì)胞（>100,000 cells/孔）可縮短孵育時(shí)間至2 h。
6）對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸掉舊的培養(yǎng)液，避免槍尖刮破單細(xì)胞層。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)液。
7）加入100 µL/孔甲臜溶解液，用槍充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。注：更長(zhǎng)的孵育時(shí)間會(huì)降低檢測(cè)靈敏度。
8）孵育結(jié)束，放置在酶標(biāo)儀上搖勻后，選擇570 nm，測(cè)定吸光度。記錄結(jié)果，比色以空白調(diào)零。如果無570 nm濾光片，可以使用560-600 nm濾光片。
注：對(duì)于細(xì)胞毒性檢測(cè)，以未經(jīng)藥物處理細(xì)胞的OD值為100%，然后計(jì)算藥物處理細(xì)胞所占的比率（x），公式如下：OD（未處理細(xì)胞）/OD（藥物處理細(xì)胞）=100%/x。然后建立直方圖。
HB210525
