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產(chǎn)品簡介
乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)，通過比色法檢測細(xì)胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實現(xiàn)對細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過51Cr釋放進行細(xì)胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。
本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD+和強生色物甲臜(formazan)，在490 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而通過比色來定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下:
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
40209ES76 |
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40209-A |
LDH釋放試劑 |
7.5 mL |
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40209-B |
乳酸溶液 |
10 mL |
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40209-C |
酶溶液 |
5 mL×2 |
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40209-D |
INT溶液(10X) |
1 mL |
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40209-E |
INT稀釋液 |
10 mL |
儲存條件
-25~-15℃保存，避光保存，有效期1年。
使用說明
1. 樣品的準(zhǔn)備：
方法一：LDH釋放檢測
1）根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80 - 90%。
2）吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細(xì)胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實驗需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0 - 10 μL左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇φ?/font>)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測時間點前1小時，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
3）到達預(yù)定時間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 g離心5 min。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進行樣品測定。
方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測
1） 細(xì)胞毒性檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80 - 90%。加入不同藥物進行處理，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 g離心5 min。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10 體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 g離心5 min。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進行樣品測定。
2）細(xì)胞增殖檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過80 - 90%。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 g離心5 min。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 g離心5 min。分別取各孔上清液120 μL，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進行樣品測定。
注：LDH釋放檢測更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測通常可以使用MTT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
1）INT溶液(1×)的配置：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10×)用INT稀釋液稀釋至1×。例如，取20 μL INT溶液(10×)，加入180 μL INT稀釋液 ，混勻后即配置為200 μL INT溶液(1×)。INT溶液(1×)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配置后凍存。
2）LDH檢測工作液的配制: 根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注：LDH檢測工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過程中均要注意適當(dāng)避光。
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檢測次數(shù) |
1次 |
10次 |
20次 |
50次 |
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乳酸溶液 |
20 μL |
200 μL |
400 μL |
1 mL |
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INT溶液(1×) |
20 μL |
200 μL |
400 μL |
1 mL |
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酶溶液 |
20 μL |
200 μL |
400 μL |
1 mL |
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總體積 |
60 μL |
600 μL |
1.2 mL |
3 mL |
(選做)如果希望進行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。
- 樣品測定:
1) 各孔分別加入60 μL LDH檢測工作液。
2) 混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30 min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490 nm處測定吸光度。使用600 nm或大于600 nm的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。
3) 計算(測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度)
細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度) / (細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100
5) 可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱坐標(biāo)為實際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。
附錄1：
可同時測定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/mL)＝(樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度) / (標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/mL)；根據(jù)計算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學(xué)差異等。
附錄2：
若需準(zhǔn)確計算出LDH酶活性的絕對活性，可通過一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對照后，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時計算出該趨勢線的公式。
A490nm＝k×LDH 酶活力單位(mU)＋b，通過Excel等軟件計算出趨勢線的斜率k和截距b。
根據(jù)上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實際吸光度(OD490)＝樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/mL)＝檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積
注意事項
1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
3. 冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測定。
4. 如果檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測時一定要設(shè)置沒有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對照孔，以用于消除背景。
5. 細(xì)胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大，都會造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。
6. 如果希望進行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。
Ver.CN20241213
