Alkaline Phosphatase Activity Detection Kit 堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒
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產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
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已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，簡(jiǎn)寫(xiě)為ALP或AKP），又稱堿性磷酸酯酶，是一組同工酶，目前已發(fā)現(xiàn)六種ALP1-ALP6。廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織，是經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。堿性條件下可催化磷酸酯鍵的水解，從而將底物分子上的磷酸基團(tuán)去除，轉(zhuǎn)化為羥基。此類底物包括核酸（DNA、RNA）、蛋白、生物堿等。常見(jiàn)的有腸道堿性磷酸酶、非組織特異性堿性磷酸酶、胎盤堿性磷酸酶等；生物學(xué)中堿性磷酸酶（ALP）水平的變化及其活性的高低常被作為一種檢測(cè)組織行為的指標(biāo)，如：1）作為iPS成功誘導(dǎo)的標(biāo)志；ALP在大多數(shù)細(xì)胞類型中均有表達(dá)，但是在iPS細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平明顯升高；2）結(jié)腸癌細(xì)胞分化程度定性和定量的指標(biāo)；3）血清中堿性磷酸酯酶的升高可導(dǎo)致高堿性磷酸酶血癥，常被認(rèn)為和惡性膽管阻塞，原發(fā)性硬化膽管炎，肝癌，肝硬化等肝膽疾病密切相關(guān)；4）血清中堿性磷酸酶活性升高還和骨骼損傷導(dǎo)致的骨生成，以及骨骼疾病如纖維骨炎、佝僂病、成骨不全等密切相關(guān)；5）堿性磷酸酶水平也會(huì)出現(xiàn)一些病理性降低的情況，多見(jiàn)于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機(jī)能不全、貧血等。對(duì)于正常成人來(lái)說(shuō)，血清內(nèi)ALP的范圍為40-150U/L。
對(duì)硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate, pNPP）是一種常用的磷酸酶顯色底物，堿性條件下，可在ALP作用下生成對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol, pNP），后者在堿性環(huán)境下呈黃色產(chǎn)物，并在405nm處可檢測(cè)到最大吸收峰。產(chǎn)物黃色越深，說(shuō)明ALP活性越高，反之則活性越低。因此，通過(guò)檢測(cè)OD405吸光值即可計(jì)算ALP活性水平。
本品為堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒，可快速、便捷地檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液/勻漿液、血清、血漿、尿液、純化酶等樣品中的ALP活性。該試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照，可進(jìn)行達(dá)100個(gè)樣品的檢測(cè)。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格（100T） |
儲(chǔ)存方法 |
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21101-A |
ALP反應(yīng)緩沖液 ALP Assay Buffer |
15ml |
-20℃ |
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21101-B |
顯色底物 pNPP Substrate |
2管 |
-20℃避光 |
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21101-C |
pNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液p-nitrophenol Standard |
100ul (10mM) |
-20℃避光 |
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21101-D |
反應(yīng)終止液 Stop Solution |
12ml |
-20℃ |
保存條件
冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，一年有效。其中顯色底物、pNP標(biāo)準(zhǔn)溶液需要避光保存。
注意事項(xiàng)
1） 如果進(jìn)行酶活力的絕對(duì)定量，進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)必須注意精確計(jì)時(shí)。此時(shí)推薦孵育30min等較長(zhǎng)時(shí)間，以減小操作過(guò)程中的時(shí)間誤差。如果樣品中酶活性較高，則可以預(yù)先適當(dāng)稀釋樣品。
2）樣品溶液中須避免出現(xiàn)EDTA、氟離子、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶抑制劑。
3）ALP反應(yīng)緩沖液和p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)人體有害，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。反應(yīng)終止液有腐蝕性，請(qǐng)小心操作。
4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
5）本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用說(shuō)明
1. 試劑準(zhǔn)備
將所有試劑取出，恢復(fù)至室溫使用。
1）顯色底物溶液：取一管顯色底物，溶解于2.5mL的ALP反應(yīng)緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上放置。注意：新鮮配制的顯色底物溶液需在數(shù)小時(shí)（≤ 6h）內(nèi)使用。
2）標(biāo)準(zhǔn)品工作液：取10μL p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10mM)，用ALP反應(yīng)緩沖液稀釋至0.2mL，使得終濃度為0.5mM。
2. 樣品準(zhǔn)備
1）細(xì)胞或組織裂解液的準(zhǔn)備：采用適當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液裂解細(xì)胞和組織，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，隨后離心取上清，用于ALP活性的檢測(cè)。
注：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。樣品可以-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。
2）血漿、血清和尿液的準(zhǔn)備：血漿和血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設(shè)置加了血漿或血清但不加底物的對(duì)照。
注：血漿制備不能用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管。尿液通常也可以直接用于測(cè)定。上述樣品可以-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。
3）樣品的稀釋：若樣品中含有較高活性的ALP，可以使用原有的裂解液或PBS等進(jìn)行稀釋，也可以采用試劑盒中的ALP反應(yīng)緩沖液進(jìn)行稀釋。若使用上述反應(yīng)緩沖液進(jìn)行稀釋，需保留足夠的緩沖液用于試劑盒的檢測(cè)過(guò)程。
3. 加樣
參考下表使用96孔板設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為4、8、16、24、32和 40μL，樣品通常可以直接加50μL。如果樣品中的堿性磷酸酶活性過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
表1 各組分加樣數(shù)據(jù)表
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空白對(duì)照（Blank） |
標(biāo)準(zhǔn)品（Standard） |
樣品（Sample） |
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ALP反應(yīng)緩沖液 |
50μL |
(100-x)μL |
(50-y) μL |
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顯色底物 |
50μL |
－ |
50μL |
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樣品 |
－ |
－ |
yμL |
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標(biāo)準(zhǔn)品工作液 |
－ |
xμL |
－ |
4. 混勻：用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進(jìn)行混勻。
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（待測(cè)樣品中ALP活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30min）
6. 終止：每孔加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。此時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品或有ALP活性的孔會(huì)呈現(xiàn)不同深淺的黃色。
7. 檢測(cè)：405nm測(cè)定吸光度。如果不能測(cè)定405nm，也可以在400-415nm范圍內(nèi)檢測(cè)吸光度。如果不能立即測(cè)定，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成測(cè)定，所顯現(xiàn)的黃色在數(shù)小時(shí)（≤ 6h）內(nèi)穩(wěn)定。
8. 結(jié)果分析
堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的二乙醇胺（diethanolamine，DEA）緩沖液中，37℃條件下，每分鐘水解pNPP顯色底物產(chǎn)生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個(gè)酶活力單位，也被稱作一個(gè)DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸緩沖液中，25℃條件下，每分鐘水解pNPP顯色底物產(chǎn)生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個(gè)酶活力單位，也被稱作一個(gè)甘氨酸酶活力單位。一個(gè)甘氨酸酶活力單位約相當(dāng)于3個(gè)DEA酶活力單位。本試劑盒測(cè)定的是DEA酶活力單位。最后，根據(jù)酶活性單位的定義，計(jì)算出樣品中的堿性磷酸酶活性。
HB180823
