Annexin V-YSFluor 647/PI Apoptosis Detection Kit Annexin V-YSFluor 647/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
Annexin V-Alexa Fluor647/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-Alexa Fluor647/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor647標(biāo)記了的Annexin V作為探針，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。
另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Alexa Fluor647 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。
本試劑盒需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 |
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40304ES20（20T） |
40304ES50（50T） |
40304ES60（100T） |
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40304-A |
Annexin V-Alexa Fluor647 |
100 μL |
250 μL |
500 μL |
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40304-B |
PI Staining Solution (20 μg/mL) |
200 μL |
500 μL |
1.0 mL |
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40304-C |
1×Binding Buffer |
10 mL |
25 mL |
50 mL |
運(yùn)輸與保存方法
冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20 ℃避光保存，避免反復(fù)凍融，一年有效期。
【注】：如果需要在短時(shí)間內(nèi)多次重復(fù)使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效期。
注意事項(xiàng)
1、由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
2、對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-Alexa Fluor647的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3、如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴?/span>PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
4、試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
5、Annexin V-Alexa Fluor647和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。
6、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
7、本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用說(shuō)明
1、 樣品染色
1.1、懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性。1.2、用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300g，4℃離心5 min。
1.3、吸棄PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。
1.4、加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10 μL PI，輕輕混勻。
1.5、避光、室溫反應(yīng)15 min。
1.6、加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。
【注】：為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。
2、流式細(xì)胞儀分析
Alexa Fluor647最大激發(fā)波長(zhǎng)為651 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為667 nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），Alexa Fluor647為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。每個(gè)樣采集10,000 events。
HB220222
