產品說明書
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COA
已發(fā)表文獻
產品描述
Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒是用EGFP標記了的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生。
其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。
另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被EGFP和PI結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。
本試劑盒適合使用流式細胞儀和熒光顯微鏡進行檢測。
產品組分
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編號 |
組分 |
產品編號/規(guī)格 |
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40303ES20（20 T） |
40303ES50（50 T） |
40303ES60（100 T） |
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40303-A |
Annexin V-EGFP |
0.1 mL |
0.25 mL |
0.5 mL |
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40303-B |
PI Staining Solution |
0.2 mL |
0.5 mL |
1 mL |
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40303-C |
1×Binding Buffer |
10 mL |
25 mL |
50 mL |
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。-20 ℃避光保存，避免反復凍融，二年有效。
【注】：如果需要在短時間內多次重復使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效。
注意事項
1）由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。
2）對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-EGFP的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。
3） 實驗中如需要固定細胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中EGFP會變性導致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細胞與Annexin V-FITC進行孵育，并用Binding Buffer洗掉未結合的Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產生細胞碎片，可以和Annexin V結合，對結果產生干擾。
4）如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？?/span>以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
5）試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
6）Annexin V-EGFP和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。
7）本產品僅作科研用途！
操作方法
實驗設計
空白管：陰性對照細胞，不加Annexin V-EGFP和 PI Staining Solution ，用于調節(jié)電壓。
單染管：陽性對照細胞，只加Annexin V-EGFP，用于調節(jié)補償。
檢測管：處理的細胞，加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution。利用空白管和單染管調節(jié)好的參數進行實驗數據的獲得。
1.1 樣品染色
1）懸浮細胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細胞；
貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4 ℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性；
2）用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min；
3）用1×Binding Buffer重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為1~5×106/mL；
4）取100 μL的細胞懸液于5 mL的流式管中，加入5 μL Annexin V-EGFP，混勻后于室溫避光孵育5 min；
5）加入10 μL PI Staining Solution，并加400 μL PBS，立刻進行流式檢測。
【注】：用流式檢測凋亡時，PI受時間的影響很大，時間過長會導致PI的染色增加，所以需要在1 h內完成流式檢測。
1.2流式細胞儀分析
EGFP最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為507 nm；PI-DNA復合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），EGFP為橫坐標，PI為縱坐標。每個樣采集10，000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。
HB221008
