成人欧美一区二区三区,天天干天天操天天爱,免费特黄一级欧美大片在线看 ,亚洲中文字幕无码一区日日添

    <span id="alen4"></span>

    <li id="alen4"></li>
    

      
    
        
       
       
       
       
      HieffNGS? Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina?(for 1 ng)
       
      更多活動更多優(yōu)惠，盡在翌圣商城》
       
       
       已下架 
       
      產(chǎn)品說明書
                  
      FAQ
                  
      COA
                  
      已發(fā)表文獻
                  
       
      操作手冊
      


      ATAC實驗操作流程 點擊下載
      


       
      


      產(chǎn)品描述
      


       
      


      Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)是針對lllumina®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的轉(zhuǎn)座酶法建庫試劑盒，適用于1 ng的基因組DNA、cDNA、擴增子（>500 bp）等樣本的建庫。與常規(guī)分步法建庫相比，Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®采用新型轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系，僅需10 min即可完成DNA片段化、末端修復和接頭連接過程，顯著縮短建庫時間至1.5小時以內(nèi)，并獲得優(yōu)異的測序質(zhì)量。此外，本試劑盒已經(jīng)不同GC含量DNA樣本的驗證，無偏好性或僅具有極低的偏好性。本試劑盒提供的所有試劑盒組分，都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量與功能驗證，最高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。
      


       
      


      產(chǎn)品組分
      


       
      


      
	
		
      
			
			
      組分編號
      
			      		
			
			
      組分名稱
      
			      		
			
			
      8 libraies
      
			      		
			
			
      24 libraies
      
			      		
			
			
      96 libraies
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-A
      
			      		
			
			
      5×Reaction Buffer
      
			      		
			
			
      32 μL
      
			      		
			
			
      96 μL
      
			      		
			
			
      384 μL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-B
      
			      		
			
			
      Transposome Mix V1
      
			      		
			
			
      40 μL
      
			      		
			
			
      120 μL
      
			      		
			
			
      480 μL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-C
      
			      		
			
			
      PCR Primer Mix
      
			      		
			
			
      24 μL
      
			      		
			
			
      72 μL
      
			      		
			
			
      288 μL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-D
      
			      		
			
			
      2×Ultima Amplification Mix
      
			      		
			
			
      200 μL
      
			      		
			
			
      600 μL
      
			      		
			
			
      2×1200 μL
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-E
      
			      		
			
			
      N5 (N501)*
      
			      		
			
			
      8 μL
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-F
      
			      		
			
			
      N7 (N701)*
      
			      		
			
			
      4 μL
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      12206-G
      
			      		
			
			
      N7 (N702)*
      
			      		
			
			
      4 μL
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
			
			
      ——
      
			      		
		
      
	      

      


      注意：*測序時Index序列N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA，N702-CGTACTAG。
      


       
      


      運輸與保存方法
      


       
      


      冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。
      


       
      


      注意事項
      


       
      


      一、關于操作
      


      1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
      


      2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
      


      3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打或輕輕振蕩混勻，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。
      


      4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。試劑吸取時應保證槍頭適當深入液體，排出時應確認槍頭無殘留。
      


      5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。
      


      6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
      


      7.本產(chǎn)品僅用作科研用途！
      


      二、關于產(chǎn)品原理
      


      本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開發(fā)，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座機制。在Transposome Mix中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構成一個完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時，該轉(zhuǎn)座子將Adapter 1和Adapter 2接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補齊。這種產(chǎn)物經(jīng)N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）兩對引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測序文庫。
      


       圖片1.png
      


      圖1  Fast Tagment DNA建庫試劑盒原理
      


      三、關于DNA片段化（DNA Tagment）
      


      1. 本試劑盒使用轉(zhuǎn)座酶進行DNA片段化。如DNA樣品為PCR產(chǎn)物，應保證其長度>500 bp。因轉(zhuǎn)座酶無法作用于DNA末端，因此PCR產(chǎn)物最末端50 bp測序覆蓋度可能會有所降低。我們推薦您在制備PCR產(chǎn)物時將待測區(qū)域兩末端各延長50-100 bp，以避免末端測序覆蓋度降低的情況。
      


      2. 本試劑盒適用1 ng Input DNA。在Input DNA投入前，應將其純化并溶于滅菌蒸餾水中，A260/A280 = 1.8-2.0，并使用基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等進行定量?！咀⒁猓阂?/span>Transposome Mix對DNA濃度非常敏感，所以準確的DNA濃度測定對實驗成功與否至關重要。】
      


      四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）
      


      1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。
      


      2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
      


      3. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。
      


      4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
      


      5. 磁珠使用過程中，應保證移液準確性。
      


      6. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
      


      7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存1周，-20°C可保存1個月。
      


      五、關于文庫擴增（Library Amplification）
      


      1. 使用本試劑盒必須進行文庫擴增步驟。因轉(zhuǎn)座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA文庫，必須通過PCR反應生成完整的DNA文庫。
      


      2. 當Input DNA量為1 ng時，推薦使用8-15個擴增循環(huán)，13個循環(huán)的文庫產(chǎn)出約為600 ng。
      


      六、關于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
      


      1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。
      


      2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。
      


      3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
      


      4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。
      


      5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。
      


       
      


      使用方法
      


       
      


      一、自備材料
      


      1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。
      


      2. 文庫質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。
      


      3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）。
      


      4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
      


      二、操作流程
      


      image.png 
      


       
      


      三、操作步驟
      


      3.1 DNA片段化（DNA Tagment）
      


      1. 準備工作：將Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
      


      2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應體系。
      


      表1  片段化反應體系
      


      
	
		
      
			
			
      名稱
      
			      		
			
			
      體積（μL）
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      1 ng Input DNA 
      
			      		
			
			
      x
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      5×Reaction Buffer
      
			      		
			
			
      4
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Transposome Mix V1
      
			      		
			
			
      5
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      ddH2O
      
			      		
			
			
      Up to 20 μL
      
			      		
		
      
	      

      


      3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
      


      4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表2所示反應程序，進行片段化反應。
      


       
      


      表2  片段化反應程序
      


      
	
		
      
			
			
      溫度
      
			      		
			
			
      時間
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      熱蓋105°C
      
			      		
			
			
      On
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      55°C
      
			      		
			
			
      10 min
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      4°C
      
			      		
			
			
      Hold
      
			      		
		
      
	      

      


      3.2 文庫擴增（Library Amplification）
      


      1. 提前將表3中的試劑解凍混勻，置于冰上備用。
      


      2. 片段化程序結(jié)束后，立即將PCR管置于冰上配制表3中PCR反應體系。
      


      表3  PCR擴增反應體系
      


      
	
		
      
			
			
      名稱
      
			      		
			
			
      體積（μL）
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      片段化產(chǎn)物
      
			      		
			
			
      20 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      PCR Primer Mix
      
			      		
			
			
      3 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      N5XX*
      
			      		
			
			
      1
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      N7XX*
      
			      		
			
			
      1 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      2×Ultima Amplification Mix
      
			      		
			
			
      25 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      ddH2O
      
			      		
			
			
      To 50 μL
      
			      		
		
      
	      

      


      注意：*Hieff NGSTM Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。
      


      3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
      


      4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表4所示反應程序，進行PCR擴增。
      


      表4  PCR擴增反應程序
      


      
	
		
      
			
			
      溫度
      
			      		
			
			
      時間
      
			      		
			
			
      循環(huán)數(shù)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      熱蓋105°C
      
			      		
			
			
      On
      
			      		
			 
		
      
		
      
			
			
      72°C
      
			      		
			
			
      3 min*
      
			      		
			
			
      1
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      95°C
      
			      		
			
			
      30 sec
      
			      		
			
			
      1
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      95°C
      
			      		
			
			
      spacer.gif10 sec
      
			      		
			
			
      n cycles**
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      55°C
      
			      		
			
			
      30 sec
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      72°C
      
			      		
			
			
      30 sec
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      72°C
      
			      		
			
			
      5 min
      
			      		
			
			
      1
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      4°C
      
			      		
			
			
      Hold
      
			      		
			 
		
      
	      

      


      注意：*此步不可省略。轉(zhuǎn)座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。
      


      **循環(huán)數(shù)請根據(jù)測序需要進行選擇。起始DNA量為1 ng時，推薦8-15個擴增循環(huán)。
      


      3.3 文庫純化或分選（Library Clean UP/Size Selection）
      


      如對文庫長度分布無特殊要求，可直接使用1.0×磁珠純化擴增產(chǎn)物，而不進行片段分選。如需進行片段分選，則進行以下步驟，推薦使用Cat#12601 DNA Selection Beads進行產(chǎn)物片段分選，為防止接頭或大片段殘留，可進行兩次片段分選，或先使用1.0×磁珠純化擴增產(chǎn)物后再進行分選。
      


      1. 將平衡至室溫的Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻。
      


      2. 根據(jù)DNA片段長度要求，進行雙輪分選時，需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補齊至100 μL，參考表5推薦比例向文庫上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。【注意：因PCR過程中樣品揮發(fā)會導致產(chǎn)物體積不足50 μL，進行下面操作之前必須使用滅菌蒸餾水將體積補齊至100 μL，否則分選長度會與預期不一致?！?/span>
      


      表5  磁珠文庫分選推薦比例
      


      
	
		
      
			
			
      文庫平均總長度
      
			      		
			
			
      ~300 bp
      
			      		
			
			
      ~400 bp
      
			      		
			
			
      ~500 bp
      
			      		
			
			
      ~800 bp
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      第一輪磁珠用量
      
			      		
			
			
      80 μL (0.8×)
      
			      		
			
			
      70 μL (0.7×)
      
			      		
			
			
      60 μL (0.6×)
      
			      		
			
			
      50 μL (0.5×)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      第二輪磁珠用量
      
			      		
			
			
      20 μL (0.2×)
      
			      		
			
			
      20 μL (0.2×)
      
			      		
			
			
      20 μL (0.2×)
      
			      		
			
			
      15 μL (0.15×)
      
			      		
		
      
	      

      


      注意：“×”數(shù)均根據(jù)PCR產(chǎn)物體積補齊至100 μL計算而得，如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL。
      


      3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。
      


      4. 參考表5向上清中加入第二輪分選磁珠。
      


      7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。
      


      8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
      


      9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
      


      10. 重復步驟9，總計漂洗兩次。
      


      11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。
      


      12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
      


      13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。此外，如需獲得長度分布更集中的文庫擴增產(chǎn)物，可使用膠回收方式進行長度分選和純化；如對文庫長度分布范圍等無特殊要求，擴增產(chǎn)物也可不進行長度分選，直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化。
      


      3.4 文庫質(zhì)量控制
      


      通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項六。
      


      3.5 參考實例
      


      使用Hieff NGSTM Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®對1 ng嗜鹽桿菌gDNA樣本建庫，并分別使用1.0×磁珠進行純化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例進行長度分選，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。
      


       圖片3.png
      


      圖3  Agilent 2100 Bioanalyzer文庫質(zhì)量分析
      


       
      


      HB210811
      


       
      


       
      

         
       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883