產(chǎn)品描述

 

Percoll是一種適用性廣且操作靈活簡單的低密度梯度分離液，可用來分離細胞，亞細胞顆粒，細菌，病毒，甚至實現(xiàn)受損細胞及其碎片與完整活細胞的分離。Percoll主要由表面包被單層乙烯吡咯烷酮（PVP）的硅膠顆粒組成，直徑15-30 nm，游離PVP的含量僅占1-2%。由于顆粒大小的異質(zhì)化，離心過程以不同的速率沉淀，自發(fā)產(chǎn)生一個勻質(zhì)化且等滲的梯度，密度在1.0-1.3 g/mL之間。大部分沉淀系數(shù)＞60S的生物顆粒都可以用Percoll實現(xiàn)分離。

本品是無菌的溶液，呈無色至淺黃色，具有以下幾大特點，

1）Percoll形成的梯度密度范圍在1.0-1.3 g/mL之間，整個梯度體系都是等滲的；

2）無細胞毒性，化學惰性，不會粘附到細胞膜上；

3）可調(diào)節(jié)至生理離子強度和pH；

4）溫和條件分離細胞，亞細胞顆粒和較大病毒（低至~70S），可保持其活力和形態(tài)完整性；

5）只需角轉(zhuǎn)頭中速離心即可實現(xiàn)預成梯度或者自發(fā)形成梯度分離；

6）Percoll粘度低（10±5 cP at 20°C），能夠快速形成梯度和顆粒分離；采用預制梯度分離低速離心力（200-1000 × g）僅需數(shù)分至數(shù)十分鐘即可達到滿意的分離結(jié)果；

7）Percoll穩(wěn)定性高，未開封的產(chǎn)品室溫保存5年有效；開封的產(chǎn)品室溫無菌保存至少2年有效；

8）Percoll（未稀釋）可重新高壓滅菌，120°C，30 min；

 

使用方法

 

1. 不同濃度（密度）Percoll溶液的制備

注意：Percoll最好稀釋于緩沖液，生理鹽水或0.25 M 蔗糖溶液中。細胞樣本可用緩沖液如PBS來進行梯度分離；而亞細胞顆粒，有可能會在鹽離子存在的情況下聚集在一起，建議使用蔗糖溶液（終濃度0.25 M）來進行梯度分離。

1）等滲Percoll溶液（SIP）的制備

也就是將未稀釋的Percoll原液調(diào)整到等滲透于生理鹽溶液。取9份Percoll（v/v）加入1份1.5 M NaCl，10×濃縮培養(yǎng)基，1.5 M PBS或2.5 M 蔗糖溶液混勻即可。可通過加入鹽離子或者蒸餾水來調(diào)整滲透壓到最后需要的值。細胞密度取決于滲透壓，因此，SIP溶液的滲透壓常規(guī)來說需要用滲壓計來調(diào)整以確保實驗間結(jié)果的可重復性。通過以下公式來計算SIP溶液的密度，

此公式中，V_x= volume of diluting medium (mL)；V₀= volume of undiluted Percoll (mL)

ρ₀= density of Percoll (1.130+0.005 g/mL)；

ρ₁₀= density of 1.5 M NaCl=1.058 g/mL(minor differences for other salts)；

        density of 2.5 M sucrose=1.316 g/mL(minor differences for other additives)

ρ_i= density of SIP solution produced(g/mL)

Thus, for SIP in saline, ρ_i=1.123 g/mL and for SIP in sucrose, ρ_i=1.149 g/mL, assuming ρ₀=1.130 g/mL.

2）稀釋SIP溶液至更低密度

直接使用0.15 M NaCl或1×細胞培養(yǎng)液（正常滲透壓）稀釋SIP到需要的密度，用于細胞分離；直接使用0.25 M 蔗糖溶液稀釋SIP用于亞細胞或者病毒分離。通過以下公式來計算調(diào)整SIP到需要的密度，

此公式中，V_y= volume of diluting medium in mL; V_i= volume of SIP in mL;

ρ_i= density of SIP in g/mL; ρ = density of diluted solution produced in g/mL;

ρ_y= density of diluting medium in g/mL

    (density of 0.15 M NaCl is～1.0046 g/mL)

    (density of 0.25 M sucrose is～1.032 g/mL)

例如：To dilute 55 mL of SIP to a final density of 1.07 g/mL,determine the amount of 0.15 M NaCl required.

 

Volume of 0.15 M NaCl required =55×            =44.6 mL

 

注意：以上公式調(diào)整得到的實際密度僅僅與預定密度非常接近，并不能保證完全相同。因為加入體積和稀釋液密度的微小變化都會影響最終結(jié)果。要想知道實際密度，建議使用密度計或折射儀來測定。

2. 一步法稀釋Percoll到需要密度（可選）

根據(jù)以下方法直接將Percoll原液稀釋到已知密度的工作液。在量筒內(nèi)，加入1.5 M NaCl或2.5 M 蔗糖到1/10終體積溶液，然后用蒸餾水稀釋到最終體積量。根據(jù)以下公式計算需要的Percoll原液的體積，

此公式中，V₀= volume of undiluted Percoll (mL); V= volume of final working solution (mL);

ρ₀= density of Percoll (undiluted) (g/mL);  ρ= desired density of final solution (g/mL)

ρ₁₀= density of 1.5 M NaCl=1.058 g/mL (minor differences for other salts)

        density of 2.5 M sucrose=1.316 g/mL (minor differences for other additives)

例如：To prepare 100 mL of working solution of Percoll of density 1.07 g/mL in 0.15 M NaCl. To 10 mL of 1.5 M NaCl, add

 

Volume of Percoll required =100× =49.4 mL (if percoll density is 1.130 g/mL)

 

and make up to 100 mL with distilled water.

注意：以上公式調(diào)整得到的實際密度僅僅與預定密度非常接近，并不能保證完全相同。因為加入體積和稀釋液密度的微小變化都會影響最終結(jié)果。要想知道實際密度，建議使用密度計或折射儀來測定。

3. 不連續(xù)（Discontinuous）密度梯度的制備

1） 根據(jù)以上公式將SIP溶液稀釋到需要的一系列不同密度；

2） 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。使用槍頭或者寬口針頭的注射器按照高密度向低密度逐層放置的先后順序，緊貼管壁，任液體自然慢慢流下，確保上層溶液不會濺入下層或者混入分界處。

1. 裝樣：樣品體積和細胞濃度根據(jù)不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。

2. 離心：一般采用離心力為400 × g，時間20～25 min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。

3. 取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。