酶是一類具有催化活性的生物大分子，本質(zhì)為蛋白質(zhì)或核酸分子，是細胞內(nèi)推動生化反應有序進行的關鍵組分。盡管酶的真實身份直到20世紀初才被揭示，但早在公元前21世紀人類就已經(jīng)有意識地利用酵母中的酶來釀造谷酒，其主要工藝及酒曲制備的方法流傳至今。酶本質(zhì)的揭秘大幅度加速了酶的發(fā)現(xiàn)和酶學反應的研究，也極大地拓寬了酶的應用領域。經(jīng)過數(shù)十年的高速發(fā)展，人類已不再滿足于新酶的發(fā)現(xiàn)和微生物的篩選，尤其在巨大商業(yè)利益的驅(qū)動下，酶的定向進化技術已開始在工業(yè)界大顯身手。
酶的定向進化指人為選擇和改善酶的性質(zhì)，使其獲得更高的催化效率或更強的選擇性等，以適應特定的應用場景。相比于自然進化，人工篩選取代了自然選擇，縮短了酶分子性能進化周期，豐富了酶的底物譜和反應類型等（圖1）。在合成生物學蓬勃發(fā)展的背景下，酶的定向改造成為了傳統(tǒng)生物育種和代謝途徑優(yōu)化的有效補充，能夠精準地提升催化路徑的效率以及開辟新的催化和代謝通路。
圖1. 定向進化原理
（圖片源自：doi: 10.1021/acs.chemrev.1c00260.）
定向進化主要包括文庫構建與突變體篩選兩部分，關鍵點則在于建立基因型和表型（即突變體性能）之間的物理對應關系。本文小編主要介紹文庫構建的部分。
突變體文庫的構建大致可分為三種方法（圖2）：隨機突變，定點突變和基因重組。
圖2. 突變體文庫的構建
（圖片源自：doi: 10.1002/bit.28009. Epub 2022 Jan 7.）
隨機突變
隨機突變包括以菌株誘變?yōu)槊浇榈捏w內(nèi)隨機突變和以易錯PCR為代表的體外隨機突變。
當微生物內(nèi)的DNA聚合酶（如大腸桿菌DNA聚合酶III ε亞基DnaQ和聚合酶I）發(fā)生突變，或者DNA錯配修復相關蛋白（如MutS、SeqA）、核苷酸修飾及代謝基因（如Dam、UGI、PmCDA1）異常表達時，堿基突變出現(xiàn)的概率大幅度提高，此過程將伴隨著微生物基因組復制而全局性地發(fā)生（如PACE進化系統(tǒng)）。體內(nèi)誘變雖然簡化了建庫流程，但由于過程不可控從而提高了宿主致死和目的蛋白失活的風險。體外的隨機突變則可在PCR的基礎上通過以下方式實現(xiàn)：引入干擾物降低DNA聚合時的保真性（如二價金屬離子、醇等）或直接使用易錯DNA聚合酶（圖3）、降低模板濃度、投入dNTP類似物或比例失衡的dNTP。獲得的DNA產(chǎn)物再經(jīng)過重組、轉化等環(huán)節(jié)完成突變體文庫的制備。易錯PCR可以有效避免宿主的死亡，并實現(xiàn)對目的基因突變范圍、突變頻率的靈活控制。
圖3. 基于易錯PCR的隨機突變
（圖片源自：doi: org/10.1016/j.trechm.2022.02.004.）
隨機突變可以用極低的成本獲得巨大的突變體文庫，用于多種應用場景的篩選，但依然面臨著一些挑戰(zhàn)：堿基突變的偏好性使得部分突變類型缺失，影響了文庫的均一性和多樣性。為了解決這個問題，Twist Bioscience開發(fā)了硅基DNA合成平臺，可個性化定制并體外合成無偏倚的寡核苷酸，保證在一定范圍內(nèi)（300 bp內(nèi)）實現(xiàn)全位點的飽和突變。但超過300 bp尺度的合成文庫的構建則只能寄希望于新的技術來尋求突破。
定點突變
定點突變是指基于大量實驗數(shù)據(jù)、文獻資料或者計算機輔助來確定熱點氨基酸，再針對性地設計并引入突變。
制備定點突變文庫最經(jīng)濟的方法是設計簡并引物，引物上目標區(qū)域的堿基隨機排布，蛋白質(zhì)的特定三聯(lián)密碼子將可能出現(xiàn)包含終止子在內(nèi)的所有類型。構建好的文庫可涂布于固體平板上，挑取單克隆培養(yǎng)后進行篩選。不過，受簡并引物均一性、菌株生長偏好性等因素的影響，測試的樣品數(shù)量需超過理論突變類型總量的3倍以上，才能實現(xiàn)超過95%的覆蓋度（圖4）。
圖4. 測試深度與樣本覆蓋度
（圖片源自：doi: 10.1002/cbic.200800298.）
除了上述包含全組合堿基的簡并引物外，一些針對氨基酸類型而設計的簡并引物可顯著減少理論突變體的種類（如NNK、NDT文庫），提升篩選效率。構建定點突變文庫除了需要一定的理論基礎外，在熱點氨基酸數(shù)量較多、分布零散時，引物設計和質(zhì)粒構建將面臨較大挑戰(zhàn)，文庫體量也將因為位點數(shù)目的增加而成指數(shù)級放大。
另一方面，體內(nèi)的定點突變技術也取得了一些進展。這些策略的主要原理是將序列特異性DNA結合蛋白（如轉錄因子、調(diào)控因子、轉座酶等）與一些堿基修飾酶、切口酶、核酸酶等融合，DNA結合蛋白負責靶向目標序列，融合酶則負責在目標區(qū)域附近引入突變（圖5）。目前，這類策略還只能在靶向序列側翼數(shù)十個堿基以內(nèi)引入突變，且具體突變位點和突變類型難以控制，結合蛋白的脫靶效應也會帶來宿主死亡的風險。
圖5. 體內(nèi)定點突變
（圖片源自：doi: org/10.1016/j.trechm.2022.02.004.）
基因重組
基因重組是指將不同來源的DNA片段進行重新組合，以形成新的DNA分子或基因的過程。在構建突變文庫時DNA片段一般有兩種來源，一種是同源酶蛋白的DNA，當序列一致性不足時可通過密碼子優(yōu)化來提升；另一種是不同突變體的DNA，可作為隨機突變和定點突變文庫的補充。此外，考慮到真核生物mRNA的可變剪切，外顯子重排（Exon shuffling）也是一種提升蛋白多樣性的方法。作為建庫母本的長片段先經(jīng)過酶切、超聲等處理成短的DNA片段，再通過PCR或者連接酶完成片段的多樣性裝配，最終形成一些規(guī)?？捎^、序列組合新穎的突變體文庫（圖6）。尤其當親本酶性能差異顯著時，基因重組可能產(chǎn)生一些功能全面、性能卓越的子代酶。
圖6. DNA重排
（圖片源自：doi: org/10.1016/j.trechm.2022.02.004.）
文庫的質(zhì)量是定向進化成功的先決條件，突變體的多樣性越多、庫容量越大，越容易篩選獲得符合預期的突變體，但文庫的總量又受制于篩選技術的通量，以及酶功能與結構信息的準確性。不僅如此，文庫構建所涉及的分子生物學技術（如連接方式、轉化方法）和耗材（如感受態(tài)細胞、限制性內(nèi)切酶、重組酶等）也是易被忽視的影響因素。
綜上所述，不同突變體文庫構建的方法總結如下表，實際可根據(jù)不同需求選擇。
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