MicroRNAs（miRNAs）是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。miRNA主要與靶基因mRNA3‘端非編碼區(qū)域特異性結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因mRNA的翻譯過程，從而阻斷mRNA翻譯和促進(jìn)mRNA降解導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)降低。miRNA的作用涉及個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。
圖.miRNA體內(nèi)合成示意
miRNA研究的關(guān)鍵是如何準(zhǔn)確且特異性地檢測分析miRNA。目前檢測分析miRNA的方法中最為常用的是熒光定量PCR。但是miRNA本身相對較小，傳統(tǒng)的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量方法難以高效的保證miRNA的檢測，選對適配的方法此時(shí)則顯得尤為重要。
傳統(tǒng)的有機(jī)提取通常提取的是較大分子量的RNA，例如mRNA和核糖體RNA，但對于miRNA的提取效果則不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇類沉淀。針對這個(gè)問題，翌圣匠心研發(fā)了專門針對miRNA提取的產(chǎn)品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細(xì)胞/組織miRNA提取試劑盒。
產(chǎn)品推薦
19331ES-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細(xì)胞/組織miRNA提取試劑盒
采用MolPure® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液體系，適用于從多種新鮮或凍存的動物組織或培養(yǎng)細(xì)胞中快速提取各種小RNA。試劑盒內(nèi)的MolPure® RNA Column M1可選擇性吸附核酸，不吸附蛋白質(zhì)、多糖和其它非核酸類物質(zhì)；microRNA Column M1則能從總RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。
產(chǎn)品性能
- 快速，簡捷，可在30分鐘內(nèi)完成miRNA提取
- 不用乙醇沉淀，減少小分子RNA丟失
成熟的miRNA的長度只有20nt左右，通常正向引物就會覆蓋其全長甚至?xí)卸嘤嗖糠郑聪蛞锞蜔o處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉(zhuǎn)錄時(shí)設(shè)法增加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度。常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。
加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，合成加長的miRNA對應(yīng)cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的通用序列作為引物合成加長的miRNA對應(yīng)cDNA第一鏈，后續(xù)擴(kuò)增過程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在適宜的溫度下會被打開，和相關(guān)擴(kuò)增引物結(jié)合。
圖. 加尾法合成miRNA
圖.莖環(huán)法合成miRNA
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類別 |
加尾法 |
莖環(huán)法 |
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適用性 |
適合于同時(shí)研究多種不同miRNA的情況 |
適合對樣本中少量幾個(gè)miRNA的精確定量檢測 |
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優(yōu)點(diǎn) |
一次反轉(zhuǎn)錄可檢測多個(gè)miRNA，通量高 |
一次反轉(zhuǎn)錄只能檢測一個(gè)miRNA，特異性強(qiáng) |
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反轉(zhuǎn)錄體系 |
內(nèi)參與miRNA一起，在同一個(gè)反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確性高 |
內(nèi)參與miRNA分開，在兩個(gè)體系分別反轉(zhuǎn)錄，容易產(chǎn)生誤差 |
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檢測特異性 |
★★★★☆ |
★★★★★ |
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檢測靈敏度 |
★★★★★ |
★★★★☆ |
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實(shí)驗(yàn)時(shí)間 |
★★★★☆ |
★★★★★ |
產(chǎn)品推薦
翌圣miRNA加尾法反轉(zhuǎn)定量組合（11148ES&11171ES)
11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
試劑盒采用加尾法來進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有原料和引物，并經(jīng)過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉(zhuǎn)錄過程同時(shí)高效進(jìn)行。
11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。DNA 聚合酶采用化學(xué)修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
產(chǎn)品性能
- 可兼容全平臺qPCR儀器
圖. 以293T細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內(nèi)參基因。
- 檢出率高，最高可達(dá)10 pg
圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細(xì)胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度： 60拷貝到606拷貝（6個(gè)梯度）和10 pg-100 ng(5個(gè)梯度)，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達(dá)情況。
- 高特異性，能區(qū)分同家族miRNA間單堿基差異
圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個(gè)Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%計(jì)算匹配率。結(jié)果顯示，可有效區(qū)分密切相關(guān)的亞型家族成員。
- 擴(kuò)增效率出色
圖. 以人293T細(xì)胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴(kuò)增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結(jié)果顯示，與同類產(chǎn)品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應(yīng)體系，具有優(yōu)異的表現(xiàn)。
- 穩(wěn)定性優(yōu)秀，在 37℃穩(wěn)定7天或凍融50次或配置體系在25℃保留48 h，效果依舊穩(wěn)定
圖. 以293T細(xì)胞Total RNA為模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表達(dá)情況?！鰿t<0.5。
翌圣miRNA莖環(huán)法反轉(zhuǎn)定量組合（11139ES&11170ES)
11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉(zhuǎn)錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達(dá)19.8 kb的cDNA。
11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
本產(chǎn)品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行miRNA定量反應(yīng)的專用預(yù)混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時(shí)對特異性要求極高。本品基于熱啟動的 DNA 聚合酶，配以優(yōu)化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴(kuò)增；同時(shí)，特殊的ROX Reference Dye，使得預(yù)混液適應(yīng)于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。
- 可兼容全平臺qPCR儀器
圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋40倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增人源的mmu-miR-125a基因。
- 靈敏度高，可達(dá)10 pg
圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA 以10倍梯度稀釋（范圍10pg /μL-0.1μg /μL），擴(kuò)增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。
- 高特異性，能區(qū)分同家族miRNA間單堿基差異
圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%計(jì)算匹配率。
- 重復(fù)性好
圖.以人293T細(xì)胞的Total RNA為模板反轉(zhuǎn)錄，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋50倍，使用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）進(jìn)行90孔平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增人源的hsa-let-7a基因。
- 穩(wěn)定性好，37℃穩(wěn)定14天或凍融穩(wěn)定50次或配置體系在25℃保留24h后，效果依舊穩(wěn)定
圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋100倍，擴(kuò)增鼠源的mmu-miR-132基因。
