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      復制型慢病毒RCL檢測Kit助力CAR-T產品質控放行
       
      

      

      

      

      

      慢病毒及其包裝系統(tǒng)
      

      

      

      

      

      


      

      慢病毒（Lentivirus, LV）是逆轉錄病毒科下的一個屬，是一種有包膜的RNA病毒，直徑約80-120nm，呈二十面體對稱結構、球形。它的病毒顆粒最外層是包膜（包膜蛋白決定了感染細胞的類型），再往里依次為基質蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶。
      


      

       
      

      


      通常，對慢病毒的利用，更多的是通過慢病毒載體來進行的。慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主的染色體上，從而達到外源基因的持久性表達，是體外和體內基因傳遞的有效工具。此外，與其他的逆轉錄病毒載體相比，慢病毒載體可以將轉基因技術整合到分裂和非分裂細胞的基因組中。
      


      

       
      

      


      慢病毒感染宿主細胞，需要先進行病毒包裝。慢病毒包裝系統(tǒng)一般由慢病毒表達載體和慢病毒包裝質?；旌衔铮∕ix）共兩部分組成：慢病毒表達載體（即穿梭載體）含包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的全部遺傳信息，是慢病毒包裝系統(tǒng)的主要組成部分；慢病毒包裝質?；旌衔铮∕ix）含一個包裝元件質粒，表達gag/pol以及各種輔助蛋白，還含有一個包膜蛋白質粒，表達VSV-G包膜糖蛋白。
      


      

       
      

      


      為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到包裝所用的細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。
      


      

       
      

      


      慢病毒感染體系完整保留了原本逆轉錄病毒高表達效率和長表達時間的優(yōu)點，并且在感染能力上有了巨大的提升。慢病毒載體是目前產業(yè)應用最成熟的病毒載體類型，尤其是在免疫細胞治療，如CAR-T療法中起到了關鍵性的作用。且從目前為止的表現上看，CAR-T發(fā)生的部分安全性問題都與慢病毒的使用無關。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      復制型慢病毒（RCL）概念
      


      及法規(guī)監(jiān)管要求
      

      

      

      

      

      


      

      大多數應用于細胞基因治療的逆轉錄病毒和慢病毒均被設計為復制缺陷型病毒載體。對于復制缺陷型病毒載體，在生產中可能發(fā)生經缺失改造的載體與野生型病毒序列之間的同源重組，導致產生復制型病毒。終產品中復制型病毒的存在有可能引起病人不良反應，構成臨床隱患和潛在危險，甚至引發(fā)腫瘤，故對復制型病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目。
      


      

       
      

      


      盡管目前慢病毒載體的設計和生產系統(tǒng)的保障措施基本消除了復制型慢病(Replication competent lentivirus，RCL)重組產生的可能性，但仍不能完全排除污染的風險。因此應進行RCL的檢測。
      


      

       
      

      


      目前，中國、美國及歐洲的藥品監(jiān)管相關機構對于RCL的檢測都出臺了明確的指導原則用于慢病毒生產及應用的不同階段監(jiān)測是否存在RCL。
      


      

       
      

      


      國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）發(fā)布的《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中提到病毒載體制備工藝中，復制型病毒是過程控制中的安全性風險關注點之一，應采用經驗證的方法開展檢測。常見的檢測方法包括指示細胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等。建議采用指示細胞培養(yǎng)法對慢病毒載體進行RCL檢測。RCL檢測指標方面，通常認為p24蛋白、逆轉錄酶活性、psi-gag和VSV-G序列等的檢出可反映RCL的存在，結合病毒載體具體情況和研究情況，選擇合適的檢測指標。
      


      

       
      

      

      


      

      

      


      

       
      


      美國FDA 2020年發(fā)布的關于RCR/RCL檢測指南提出：對于RCR/RCL的檢測包含指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測定)、PCR/Q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應）、PERT法（產物增強性逆轉錄檢測法）共4種檢測方法。
      


      

       
      

      


      其中，指示細胞培養(yǎng)法和Q-PCR法較常用，但各國監(jiān)管機構推薦并且可以接受的方法還是以指示細胞培養(yǎng)法為準。由于細胞產品一般要新鮮輸注或快速凍存的特殊性，可使用Q-PCR法先進行質控放行，但指示細胞培養(yǎng)法應同時進行確認。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      復制型慢病毒RCL檢測
      

      

      

      

      

      


      

      鑒于RCL的潛在威脅，從慢病毒載體生產工藝的各個環(huán)節(jié)：主細胞庫(MCB)、工作細胞庫(WCB)、終末端細胞(EOPC)、慢病毒收獲液(UPB)、轉導細胞甚至CAR-T治療病人的臨床樣本都需要進行嚴格的質控檢測來核實是否存在RCL，從而可以最大限度地避免病人因CAR-T治療發(fā)生二次腫瘤。
      


      

       
      

      


      復制型慢病毒RCL的指示細胞培養(yǎng)法檢測需28天，耗時較長；而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有檢測時間短、靈敏度高、可重復性強等優(yōu)點。目前，許多CAR-T申報企業(yè)采用Q-PCR/PCR方法直接測定終產品中的VSV-G序列或psi-gag序列，作為快速放行方法。
      


      

       
      

      


      針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了復制型慢病毒RCL檢測試劑盒，采用熒光探針qPCR法特異性擴增慢病毒的包膜蛋白VSV-G基因序列，專一快速的檢測各種使用慢病毒載體相關的細胞產品中可能發(fā)生的復制型慢病毒的潛在風險。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。
      


      

       
      

      


      下圖就復制型慢病毒RCL檢測工作流程，進行了詳細介紹：
      

      


      

      

      


      

      

      

      

      

      

      產品性能：
      

      

      

      


      

       
      

      


      

      符合法規(guī)：按照法規(guī)要求進行全面驗證，可提供驗證報告；
      


       
      


      保障品質：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產品在超潔凈酶工廠生產；
      


       
      


      靈敏度高：定量限可達101copies/μL水平；
      


       
      


      精密度高：批內重復性高，批間差異小；
      


       
      


      專屬性強：特異性檢測VSV-G基因，不受其他外源基因組DNA干擾；
      


       
      


      防干擾強：添加內部對照（IC），便于排除樣本干擾、反應配制異常等因素。
      

      

      

      

      


      

      

      

      

      

      產品信息
      

      

      

      

      

      


      

      
	
		
      
			
			
      產品
      
			      		
			
			
      貨號
      
			      		
			
			
      品名
      
			      		
			
			
      規(guī)格
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      樣本前處理試劑盒
      
			      		
			
			
      18416ES
      
			      		
			
			
      MolPure ® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）
      
			      		
			
			
      25T/100T
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      18642ES
      
			      		
			
			
      MolPure ® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預封裝）
      
			      		
			
			
      2*16T/6*16T
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      核酸提取儀器
      
			      		
			
			
      80501ES
      
			      		
			
			
      Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A 全自動核酸提取儀
      
			      		
			
			
      32通量
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      qPCR檢測試劑盒
      
			      		
			
			
      41311ES
      
			      		
			
			
      復制型慢病毒(RCL)檢測試劑盒
      
			      		
			
			
      50T/100T
      
			      		
		
      
	      

      

      


      

      

      

      

      

       
      


      參考文獻
      

      

      

      

      

      


      

      [1] Naldini L, Blömer U, Gallay P,etc. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7. PubMed PMID: 8602510.
      


      [2]萬海粟,周清華.慢病毒載體及其研究進展[J].中國肺癌雜志,2014,12(17):12.DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.12.09.
      


      [3]國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）, 2022.
      


      [4]FDA．Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up［EB/OL］(2018 )．
      


      [5]EMA. Guideline on quality，non-clinical and clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products in clinical trials［EB/OL］．(2019)．
      


       
      

      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883