SNP檢測方法眾多，大約有20多種，包括基于陣列的雜交、PCR和測序等，本文主要介紹基于PCR技術的部分基因分型方法。
ARMS PCR的全稱是突變擴增阻滯系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR），也稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA聚合酶無法修復引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴增受阻的檢測方法。
ARMS PCR將SNP位點設計在上游引物3’末端，結合Taqman探針的方法檢測熒光信號值，從而判斷野生型和突變型等位基因。換言之，我們應用ARMS PCR對野生型和突變型等位基因進行檢測時，需要設計兩條3’端核苷酸分別對野生型和突變型特異的上游引物，以及一條通用的下游引物，一條通用的探針。在Taq DNA聚合酶作用下，與模板不能完全匹配的上游引物將不能完全形成互補堿基對，從而產(chǎn)生錯配，鏈延伸反應因3’,5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，不能進行延伸，而與模板完全匹配的引物體系則可以持續(xù)延伸，由于Taq酶5’到3’外切酶活性，可將Taqman探針上的熒光基團水解，導致探針上熒光基團與淬滅基團的距離增大，從而使得熒光信號被儀器檢測到，最終計算出對應的△Ct值。
圖2.ARMS-PCR檢測原理
圖3.四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR檢測原理
引物探針設計
首先，針對SNP的等位基因設計兩條對應的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點上，同時引物5’端各自帶有一段獨特的標簽序列，而下游引物則是一條常規(guī)設計共用的引物。引物一共是三條，兩條帶有標簽序列的分型上游及一條通用下游。其次，設計兩條與上游引物標簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標記不同的熒光基團，同時對應于熒光探針設計各自互補配對的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標記淬滅基團，探針一共是四條，兩條熒光探針和兩條淬滅探針。
在第1輪PCR擴增中，等位基因特異引物（3'末端能配對的）就可識別特定等位基因模板，完成等位基因識別，反向通用引物也會結合并完成整個PCR過程，在此階段，熒光探針仍與其互補的淬滅探針結合，不會產(chǎn)生熒光信號。從第2輪PCR擴增開始，產(chǎn)物中出現(xiàn)含有通用標簽序列（tag sequence）的模板，這步之后即可把通用標簽序列引入與SNP對應的PCR產(chǎn)物中。隨后熒光探針與tag互補的DNA鏈結合而添加到PCR產(chǎn)物中，因此不再與其互補的淬滅探針結合，從而產(chǎn)生熒光信號而被檢測到。
利用熒光信號檢測儀或熒光定量PCR儀（配有相應熒光探針的檢測通道）進行信號讀取，并用軟件采集信號判別等位基因類型（如果進行聚類分析，要用到KlusterCaller或SNPviewer軟件）。
圖4.KASP法檢測原理
TaqMan探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針，在PCR反應中加入兩條兩端帶有不同熒光標記的特異探針來識別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，在探針結構完整時兩者距離較近，熒光基團的信號可被淬滅。而在PCR擴增過程中，若TaqMan探針與靶標序列完全匹配，探針則可結合在DNA模板上，此時Taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團，使得熒光信號增強。而且，隨著擴增產(chǎn)物的增多，熒光信號越來越強，從而可通過儀器實時監(jiān)測熒光信號的變化過程。
由于MGB探針的長度可以設計得更短（短至13個堿基），有利于提高探針的識別特異性，因此用于檢測SNP的TaqMan探針常用MGB修飾，在TaqMan探針的3’端結合小溝結合物（minor groove binder，MGB），MGB與DNA螺旋的小溝（minor groove）契合，通過穩(wěn)定DNA雙螺旋結構來提高雜交的準確性和穩(wěn)定性。另外MGB探針包括一個不發(fā)光的淬滅基團（NFQ），能夠真正消除傳統(tǒng)淬滅基團產(chǎn)生的背景熒光信號，提高信噪比，提高檢測靈敏度。
圖5 TaqMan探針法檢測原理
分子信標是一段雙標記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補配對，從而形成莖環(huán)結構，使得熒光基團和淬滅基團相互靠近而熒光信號較低。分子信標的環(huán)狀結構部分包含SNP檢測位點，當模板與分子信標環(huán)狀結構的核酸序列完全匹配時，分子信標可與模板雜交形成伸展狀態(tài)，從而導致熒光基團和淬滅基團的空間距離拉大，熒光信號增強，因此可被儀器檢測，并確定SNP位點。使用不同熒光基團標記的分子信標，則可區(qū)分SNP類型。
圖6.分子信標法檢測原理
分子信標法與TaqMan探針法類似，均是通過探針中單個堿基的識別能力區(qū)分SNP，只是分子信標采用莖環(huán)結構，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對SNP的識別特異性。該方法本底低，特異性高，靈敏性高，不必與未反應的探針分離即可檢測，可用于活體分析；但是探針合成時標記較復雜，設計難度大。在進行分子信標的研究和應用時,莖干區(qū)和環(huán)狀區(qū)的序列設計是關鍵所在，這種設計不僅決定了其構象，使在雜交后淬滅基團與熒光基團之間的距離達到足夠大，而且決定了其合適的使用溫度。其次，環(huán)境pH值、純度也是影響分子信標的重要因素，pH值過高，分子信標的發(fā)卡結構可能被破壞，出現(xiàn)假陽性結果。
PCR擴增的熔解曲線取決于其擴增序列，序列中一個堿基的突變都可以導致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化，通過實時熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細微的溫度變化，可以知道擴增的序列中是否有突變發(fā)生，從而對其進行基因分型。
高分辨率熔解曲線（high-resolution melting analysis, HRM）是通過特定染料與擴增特定的DNA區(qū)域，在高分辨率熔解條件下對擴增產(chǎn)物進行溫度升降，通過熔解曲線的變化區(qū)分不同的基因型或等位基因。HRM檢測通常使用飽和熒光染料（如：LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等），具有更強的DNA結合能力，且不影響PCR擴增，在DNA解鏈過程中也不會發(fā)生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
核酸片段的固有特性，如DNA序列的長度、GC含量和堿基互補性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結合高精度熒光定量PCR儀，其分辨精度則可達到對單個堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定SNP位點。
圖7.高分辨率熔解曲線法檢測SNP結果示意圖
該方法引物設計簡單，且單堿基改變、插入、缺失都能通過HRM來檢測，實驗操作簡單，不需要探針，成本相對較低，并且可以發(fā)現(xiàn)未知突變（但不能知道具體的突變類型）。但是HRM技術對實驗儀器的溫度分辨率要求相當高，需要達到0.02~0.1℃，每升高1℃采集熒光25次，以滿足對單堿基差異的區(qū)分。對溫度均一性同樣要求較高，Tm的標準偏差為0.020-0.264℃（孔間溫度均一性要達到0.264℃以內才能保證HRM分析結果的準確性），一般PCR兩孔間溫差在0.3~0.5℃，這就導致兩孔間最終熔解溫度相差較大，無法保證HRM分析結果的準確性。
翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領域深耕多年，目前已開發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測通用原料，已被下游廠家應用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學、單基因遺傳病、疾病易感性研究等多個領域。
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 備注 |
| 2×Hieff Unicon® TaqMan SNP Genotyping Master Mix | 13152ES | TaqMan探針法 |
| 2×Hieff® Blood Direct TaqMan qPCR Master Mix(Low ROX) | 13095ES | |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Mix | 13755ES | ARMS-PCR法 |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Kit | 13229ES | |
| Hieff UNICON® HotStart Super Specific Taq DNA Polymerase | 14318ES | 單酶 |
| 10×Taq PCR Buffer(with MgCl2) | 11373ES | 通用Buffer |
通過上面SNP科普般的分享，相信大家對部分主流SNP檢測方法及特點有了基本的了解，那SNP主要在哪些應用領域起作用，以及常見的SNP問題有哪些，限于篇幅原因，敬請期待下篇SNP干貨分享哦！
