表觀遺傳
1942 年，Conrad Waddington 創(chuàng)造出了“表觀遺傳學(xué)”一詞，用以定義基因型未發(fā)生改變而表型改變的現(xiàn)象，以解釋發(fā)育的各個方面。大約 3/4 個世紀以后，我們發(fā)現(xiàn)基因表達模式傳遞的表觀遺傳機制并不依賴于 DNA 序列的改變，而是通過改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)，而染色質(zhì)狀態(tài)同時是我們遺傳信息的生理學(xué)形式。表觀遺傳的調(diào)控機制包括多種方式，圖1主要介紹其中的3種：DNA甲基化、組蛋白修飾（圖1中顯示乙酰化和甲基化修飾）和非編碼RNA介導(dǎo)的調(diào)控。
表觀遺傳與人類疾病
DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等表觀遺傳因素，與腫瘤發(fā)生、免疫缺陷病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和精神疾病等多種疾病相關(guān)。DNA甲基化就像一頂“神奇的帽子”，在不改變DNA分子一級結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因組的功能，在調(diào)控基因表達、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因印記、X染色體失活以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重大的作用。
腫瘤
正常的DNA甲基化模式如果被破壞(如基因啟動子區(qū)域的甲基化程度過高或過低)都會導(dǎo)致細胞的癌變。
免疫缺陷疾病
ICF綜合征,是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)基因突變而引起的?；颊?號、9號和16號染色體異常，在其著絲粒附近具有大量重復(fù)的典型衛(wèi)星DNA序列，這些重復(fù)序列表現(xiàn)為低甲基化。
精神類疾病
瑞特綜合征是由于X染色體上編碼MeCP2轉(zhuǎn)錄因子的基因突變導(dǎo)致的。MeCP2突變導(dǎo)致該基因調(diào)節(jié)DNA甲基化的過程異常，從而致病。
甲基化研究分類
根據(jù)甲基化作用的對象不同，可以將甲基化分為：DNA甲基化、RNA甲基化以及蛋白質(zhì)甲基化。
DNA甲基化
DNA甲基化可以發(fā)生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位等，它們分別由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。目前對于DNA甲基化的研究主要關(guān)注點在5mC以及6mA，甲基化研究技術(shù)也分為WGBS（研究5mC）、RRBS（研究5mC）、MeDIP（研究5mC）、6mA（研究6mA）等。其中，WGBS和RRBS能定位到單堿基分布的甲基化研究，MeDIP以及6mA主要基于特異性的甲基化修飾位點結(jié)合抗體來識別DNA甲基化區(qū)域，具有實驗簡單、成本較低等優(yōu)點。
表.不同DNA甲基化技術(shù)對比
RNA甲基化
已知RNA存在超過100種修飾。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到了十分重要的作用，而mRNA的內(nèi)部修飾則用于維持mRNA的穩(wěn)定性。RNA最常見的內(nèi)部修飾包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羥基化（m5C）等。目前RNA甲基化的研究主要在m6A和m5C上，對應(yīng)的RNA甲基化研究技術(shù)為MeRIP（m5C）、m6A（m6A）等。這兩種技術(shù)都是基于特異性識別核酸修飾的抗體進行靶向富集，兩種技術(shù)都是非單堿基研究。
目前已經(jīng)有很多技術(shù)來解決RNA甲基化單堿基分布的問題，2024年1月2日，芝加哥大學(xué)何川教授團隊在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進行快速，準確檢測的測序方法，簡稱為UBS-seq。該技術(shù)提出的5 min快速轉(zhuǎn)化試劑盒，能夠減少傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法對RNA的損傷。
翌圣生物的Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技術(shù)開發(fā)優(yōu)化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性。
圖. Superfast DNA Methylation Bisulfite的技術(shù)原理及優(yōu)勢
Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）將DNA變性與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化融合為一步，5分鐘內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化，約30 min可完成BS轉(zhuǎn)化全流程。采用柱內(nèi)脫硫技術(shù)，使操作流程更為簡單；可以滿足100 pg-2 μg樣品的轉(zhuǎn)化；未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的轉(zhuǎn)化率≥99%；轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物適用于PCR擴增和DNA測序等下游應(yīng)用。
圖4.Superfast BS轉(zhuǎn)化實驗流程
客戶案例
客戶A：使用12225與競品Z轉(zhuǎn)化試劑盒進行頭對頭對比，轉(zhuǎn)化樣本為15 ng 甲基化puc19+非甲基化λ DNA混合物，轉(zhuǎn)化后的樣本采用甲基化單鏈DNA建庫，如圖5所示：12225文庫產(chǎn)量和對比率優(yōu)于競品Z，轉(zhuǎn)化效率和競品Z相當。
蛋白質(zhì)甲基化
蛋白質(zhì)甲基化是真核生物中普遍存在且關(guān)鍵的翻譯后修飾 (PTM)，主要發(fā)生在賴氨酸殘基和精氨酸殘基上。常見的組蛋白甲基化修飾有H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3以及H3K36me3等，不同的組蛋白修飾起不同的作用。組蛋白H3K4 （H3K4me1 和 H3K4me3）上的單甲基化和三甲基化都是活化標志物，但是也有著特殊 的細微差別：H3K4me1 通常會標記轉(zhuǎn)錄增強子，而 H3K4me3 則標記基因啟動子。同時，K36 (H3K36me3) 的三甲基化是與基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域相關(guān)的活化標志物。H3K27me3啟動子區(qū)域的一個臨時信號、H3K9me3是在具有串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)的基因貧乏染色體區(qū)域形成異染色質(zhì)的永久信號，如衛(wèi)星重復(fù)序列、端粒和近著絲粒區(qū)。其中，H3K27me3位于基因間和沉默的編碼區(qū)，H3K9me3主要位于活性基因的編碼區(qū)。對于蛋白質(zhì)甲基化有組蛋白甲基化研究CUT&Tag、ChIP-seq、CUT&RUN或者蛋白質(zhì)修飾組的質(zhì)譜研究。
表.CUT&Tag、ChIP-seq及CUT&RUN技術(shù)對比
|
CUT&Tag |
ChIP-seq |
CUT&RUN |
|
胞內(nèi)反應(yīng) |
*胞內(nèi)反應(yīng) |
胞內(nèi)反應(yīng) |
|
收集細胞，無需特殊處理 |
甲醛交聯(lián) |
收集細胞，無需特殊處理 |
|
ConA磁珠與細胞孵育 |
細胞破碎裂解，超聲打斷gDNA |
ConA磁珠與細胞孵育 |
|
一抗二抗結(jié)合目的蛋白 |
一抗結(jié)合目的蛋白 |
一抗二抗結(jié)合目的蛋白 |
|
轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) |
免疫沉淀 |
MNase酶復(fù)合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) |
|
磁珠回收DNA片段 |
洗脫，解交聯(lián)，獲得DNA片段 |
純化獲得DNA片段 |
|
一步法PCR擴增文庫 |
多步反應(yīng)：修復(fù)加A，加接頭，PCR擴增 |
多步反應(yīng)：修復(fù)加A，加接頭，PCR擴增 |
|
產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
產(chǎn)物純化，上機測序 |
|
總時長：7.5 hour |
總時長：3-5 Day |
總時長：1-2 Day |
欲知DNA甲基化、RNA甲基化以及蛋白質(zhì)甲基化如何進行關(guān)聯(lián)研究，請關(guān)注翌圣生物下回分曉。
相關(guān)產(chǎn)品推薦
|
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品應(yīng)用 |
|
Recombinant Ten-Eleven Translocase 2.0(TET2.0, with buffer) |
12212ES |
酶轉(zhuǎn) |
|
DNA Enzymatic methyl- Conversion Kit |
12213ES |
酶轉(zhuǎn) |
|
Hieff NGS® Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina® V2 |
12221ES |
單鏈甲基化文庫構(gòu)建 |
|
Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina® |
12214ES |
雙鏈甲基化文庫構(gòu)建 |
|
Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit |
12225ES |
5 min超快速化學(xué)轉(zhuǎn)化，DNA和RNA適用 |
|
Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 |
12597ES |
含二抗及全套純化磁珠的CUT&Tag試劑盒 |
