親愛的新生小伙伴們，開學(xué)的腳步越來越近啦！想必此刻的你們心中一定充滿了對未知世界的憧憬與好奇吧？但與此同時(shí)，面對琳瑯滿目的實(shí)驗(yàn)材料和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)流程，是不是也有那么一點(diǎn)點(diǎn)小迷茫呢？別擔(dān)心，小翌來幫忙！

分子克隆作為現(xiàn)代生物學(xué)研究中的基礎(chǔ)技能之一，無論是基因功能的研究還是新藥的研發(fā)，都離不開這一重要環(huán)節(jié)，小伙伴們在之后的生物實(shí)驗(yàn)中必然會(huì)接觸到這個(gè)技術(shù)。你是否還在疑惑：“到底要怎么開始我的克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?rdquo;接下來，就讓我們一步步來梳理分子克隆實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)思路！

今天我們就以pUC19載體為例設(shè)計(jì)分子克隆實(shí)驗(yàn)方案吧。

01

明確目的

通過分子克隆技術(shù)將小鼠的某一功能基因，連接到克隆載體上，進(jìn)行下游的基因功能鑒定。

 

02

確定載體

載體有三種來源途徑：

 

01

 

實(shí)驗(yàn)室改造的通用載體，通常是實(shí)驗(yàn)室根據(jù)通用的克隆和表達(dá)需求改造的，可能包括多個(gè)酶切位點(diǎn)、選擇標(biāo)記、報(bào)告基因等；

02

 

市面上購買的標(biāo)準(zhǔn)載體，由生物公司提供，比如用于蛋白表達(dá)的pET系列，或者用于克隆的pUC系列，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)載體；

03

 

定制或特殊設(shè)計(jì)的載體：當(dāng)現(xiàn)有的通用載體或市售標(biāo)準(zhǔn)載體不能滿足特定的實(shí)驗(yàn)需求時(shí)，可以通過商業(yè)合成、利用分子克隆技術(shù)自行構(gòu)建或與專業(yè)公司合作設(shè)計(jì)。

 

本次實(shí)驗(yàn)我們選用pUC19載體。

 

pUC19載體是一種常用的大腸桿菌克隆質(zhì)粒載體，載體長2,686 bp。適合于DNA片段的克隆、進(jìn)行DNA測序、對外源基因進(jìn)行表達(dá)等。pUC19載體中含有多克隆位點(diǎn)（MCS），本次計(jì)劃將目的片段插入到pUC19的MCS區(qū)域，MCS區(qū)域前有乳糖啟動(dòng)子（Lac promoter），通過乳糖啟動(dòng)子可以啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，可以用于鑒定基因的功能。

 

圖.pUC19載體圖譜

 

03

確定目的片段

確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用到的片段物種并查找序列。假設(shè)需要在載體上加入小鼠基因組DNA，可以使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線查詢，選擇“Nucleotide”，輸入小鼠拉丁文名稱“Mus musculus”，點(diǎn)擊查詢后，獲得1000多萬條基因序列，如下圖所示。

點(diǎn)擊序列如小鼠matrix metallopeptidase 1b的mRNA序列（Mmp1b基因），進(jìn)入界面后會(huì)給出該基因的來源物種、詳細(xì)名稱、功能描述、文獻(xiàn)出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點(diǎn)擊右上角的“Send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。

04

確定酶切位點(diǎn)

通過片段和載體比對，選取目的片段中不含有的酶切位點(diǎn)。使用Snapgene軟件打開小鼠Mmp1b基因序列，點(diǎn)擊“Enzymes”-“Choose Enzymes”。

在新彈出的界面中，輸入pUC19載體多克隆位點(diǎn)中酶的名稱，“Add”添加到右邊欄目中，點(diǎn)擊“ok”即可。

接著在下方欄目中點(diǎn)擊“Enzyme”，選擇“18 chosen enzymes do not cut”，在彈出的頁面中，藍(lán)色底紋即為目的片段上不含有的酶切位點(diǎn)，但載體多克隆位點(diǎn)上含有的酶切位點(diǎn)，本次一共找到18個(gè)酶切位點(diǎn)。

接下來，就可以選擇根據(jù)目標(biāo)基因的序列和pUC19上的酶切位點(diǎn)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行線性化處理，同時(shí)根據(jù)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物。為了增加后續(xù)克隆連接的效率，建議選擇酶切后會(huì)產(chǎn)生粘性末端的酶切位點(diǎn)，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇“EcoRI”和“SalI”兩個(gè)酶切位點(diǎn)。

確認(rèn)完載體、目的片段、酶切位點(diǎn)后，通過翌圣官網(wǎng)“支持中心”的“生物計(jì)算器”（http://www.vaaedu.com/calculator.html#/double-enzyme/）設(shè)計(jì)目的片段兩端的引物。

輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點(diǎn)），生成引物，如圖所示。

復(fù)制引物序列如下：

Forward 1: cgttgtaaaacgacggccagtgGTCACTGGTGATTTTCCCAGAGAAA

Reverse 1: gccaagcttgcatgcctgcaggTAGAGACAAGAGTGGCTTTATTTAA

獲得載體、片段和引物序列之后，就可以通過Snapgene模擬載體片段同源重組，確認(rèn)載體、片段設(shè)計(jì)是否有誤，方案是否具有可行性。

模擬步驟后，驗(yàn)證載體、片段設(shè)計(jì)方案可行，該實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)成功！之后我們就可以開展分子克隆實(shí)驗(yàn)操作啦~