精準檢測，至關(guān)重要

RNA病毒的宿主眾多，涵蓋幾乎所有類型的生命體。很多RNA病毒讓宿主們談虎色變，具有非常強的侵略能力，會嚴重影響宿主生命活動。我們常聽到的RNA病毒均臭名昭著之輩，如艾滋病病毒、流感病毒、登革熱病毒、煙草花葉病毒、噬菌體等。 

我們以HIV病毒急性感染期感染過程，可以看下HIV病毒精準檢測對于診斷和治療效果評估的重要性。

HIV急性感染期可分為病毒感染期、隱蔽期及病毒血癥峰，是病毒檢測的重要時期。

新英格蘭雜志進行過一項急性感染期的前瞻性研究，研究表明1.94%的急性HIV-1感染隨訪者出現(xiàn)臨床癥狀或體征；其中發(fā)熱、頭痛、周身不適等臨床癥狀大多出現(xiàn)在病毒血癥峰高峰前，心動過速、淋巴結(jié)腫大、頭頸部異常等體征大多出現(xiàn)在病毒血癥峰高峰時。可見如果通過癥狀和體征來判斷病毒感染情況，必然是錯過了最佳的治療期，因為此時病毒已經(jīng)產(chǎn)生了一定量的復制。因此在最早期階段，高靈敏地檢測出病毒，甚至精準地確認病毒的拷貝數(shù)，就可以為最大程度的控制病毒復制提供重要參考。

 

如何精準地檢測到病毒呢（定性）？是否可以有效判定出有多少個病毒呢（定量）？

我們以登革熱病毒的檢測為例，來了解一步法RT-qPCR Probe技術(shù)。 
 

一步法RT-qPCR Probe技術(shù)介紹

一步法RT-qPCR（One-Step reverse transcription-quantitative PCR）用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程與靶標基因的PCR擴增于一管內(nèi)依次進行。利用熒光標記的Probe來監(jiān)控PCR擴增產(chǎn)物的變化，進而判斷RNA初始量的技術(shù)叫做一步法RT-qPCR Probe技術(shù)。探針是一類熒光分子標記的寡核苷酸序列，根據(jù)堿基互補配對原則與PCR擴增產(chǎn)物結(jié)合，合理的設計可分辨出單個堿基變異。

1、登革熱病毒的基因分型檢測

登革熱病毒是RNA病毒，分為1-4型血清型，Den-1、Den-2、Den-3和Den-4，不同血清型會引起不同嚴重程度的疾病【1、2】，嚴重者致出血致死。因此，有效區(qū)分血清型非常必要。

當前主要檢測技術(shù)包括檢測血液中病毒核酸的分子診斷技術(shù)和測定中和抗體，前者是當前唯一能夠判定病毒血清型的方法。而基于核酸的分子診斷技術(shù)中，One Step RT-qPCR技術(shù)因檢測耗時短，工作量較小，結(jié)果可靠，且能夠?qū)颖静《据d量進行定量，而占據(jù)主導地位。

 

第一步：快速判定是否是登革熱病毒感染：

One Step RT-qPCR Probe檢測思路【3】：選取四種血清型共有的保守區(qū)域，因四種血清型的探針結(jié)合區(qū)域（保守區(qū)域）有1個堿基不同，可設計兩類Taqman探針，5’端用6-FAM熒光基團標記的taqman探針檢測Den-1和Den-3（黑色線條），5’端用JOE熒光基團標記的taqman探針檢測Den-2和Den-4（綠色線條）。也即是多重實時PCR。

 

第二步：確認為登革熱病毒感染后，區(qū)分感染的血清型：

One Step RT-qPCR Probe檢測思路：比對Den-1型、Den-2型、Den-3型、Den-4型序列，篩選出各自的保守區(qū)序列，用以設計引物和探針。

2、登革熱病毒的個數(shù)檢測

以已知數(shù)量的噬菌斑形成單位的登革熱病毒分離株梯度稀釋，以提取得到的RNA作為標準品，進行一步法RT-qPCR實驗，制作標準曲線。之后根據(jù)待測血清中得到的Ct值，判定病毒的噬菌斑形成單位數(shù)。

3、登革熱病毒檢測時，幾種基于核酸的分子診斷技術(shù)的比較

至今，最初的RT-PCR漸日落西山，處于成熟期的RT-qPCR風頭正盛，日益崛起的數(shù)字PCR大有可期。RNA病毒的分子檢測技術(shù)可謂革新不斷。一步法RT-qPCR Probe技術(shù)無需開管即保證了qPCR對產(chǎn)物的實時監(jiān)控和產(chǎn)物分析，最大程度的避免了污染（相對于RT-PCR），同時，具備更高樣本檢測通量（相對于二步法RT-qPCR）。

分子技術(shù)類型	One Step RT-PCR	One Step RT-qPCR SYBR Green I	One Step RT-qPCR Probe
實驗原理	依據(jù)四種血清型序列保守性，通過擴增子大小區(qū)分	依據(jù)四種血清型序列保守性，需要借助溶解曲線得到的Tm值大小和凝膠電泳進行判定特異性	依據(jù)四種血清型序列保守性，根據(jù)Ct值判定
靈敏度	低	高	高
檢測通量	低	高	高
污染概率	高	低	低
實驗重復性	低	高	高

 

總結(jié)
 

病原體（病毒）的精準檢測對于疾病的篩查及治療效果評估非常重要，借助分子生物學技術(shù)可以精準檢測病原體（病毒），其中的一步法RT-qPCR技術(shù)可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面，廣泛用于食品安全、動物疫病、疾病診斷與治療效果評估等臨床與公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。

翌圣生物作為酶制劑研發(fā)和生產(chǎn)者，可根據(jù)需求，通過深入地研究各類鹽離子等添加劑對酶功能的影響，定制最大酶效的Buffer；通過深入地研究核心酶分子結(jié)構(gòu)，從基因序列上對酶進行改造，優(yōu)化出性能優(yōu)越的酶類。

 

文獻

[1] Burke DS, Nisalak A, et al. A prospective study of dengue infections in Bangkok. Am J Trop Med Hyg. 1988 Jan;38(1):172-80.

[2] Eili Huhtamo, et al. Molecular Epidemiology of Dengue Virus Strains from Finnish Travelers. Emerg Infect Dis. 2008 Jan; 14(1): 80–83. 

[3] Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A , et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol. 2001 Nov;39(11):4119-24.