高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，測(cè)序通量大幅增加，要求上游樣本處理盡可能簡(jiǎn)單快速，以提高NGS整個(gè)流程的工作效率。文庫(kù)構(gòu)建，尤其是DNA文庫(kù)構(gòu)建是二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)的基礎(chǔ)，其他的建庫(kù)方法都以該方法為基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)。DNA建庫(kù)方法是分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理，其本質(zhì)就是在待測(cè)片段兩端加上接頭的過(guò)程，目前DNA建庫(kù)方法按照接頭連接方式不同可分為五類(lèi)：

● TA克隆連接接頭建庫(kù)

● Swift法建庫(kù)

● 轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)

● PCR擴(kuò)增子建庫(kù)

● 平末端連接接頭建庫(kù)

TA克隆連接接頭建庫(kù)是目前應(yīng)用廣泛的建庫(kù)技術(shù)，簡(jiǎn)單描述就是：將提取好的DNA片段化，在進(jìn)行末端修復(fù)和加A尾，然后連接上接頭（adapter），最后通過(guò)PCR擴(kuò)增（可選），中間再穿插著純化/分選步驟就完成了文庫(kù)的構(gòu)建。在這里，提前合成好的帶T尾接頭和末端帶A的目的片段在DNA連接酶的作用下通過(guò)TA克隆方式連接（圖1）。

圖1. TA克隆連接接頭建庫(kù)法流程圖

TA克隆連接接頭可以有效保留樣本幾乎所有基因組信息，非常有利于未知拷貝數(shù)的和基因組變異的檢測(cè)，是全基因組測(cè)序和外顯子測(cè)序的主要建庫(kù)手段，目前市面上有很多試劑盒供應(yīng)，直接應(yīng)用試劑盒建庫(kù)，操作簡(jiǎn)單，2.5-3.5h就可獲得穩(wěn)定高品質(zhì)文庫(kù)。

Swift建庫(kù)方案是Swift BioSciences公司獨(dú)有的NGS建庫(kù)技術(shù)，基本步驟與TA克隆連接接頭建庫(kù)方法類(lèi)似，是由TA克隆連接接頭的方法發(fā)展而來(lái)。主要通過(guò)兩步法在插入片段兩端引入P5和P7接頭序列，末端修復(fù)之后，先在3，端連接帶P7的接頭，再在5，端連接帶P5的接頭，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增（可選）完成文庫(kù)構(gòu)建（見(jiàn)圖3）。Swift法建庫(kù)主要宣傳優(yōu)勢(shì)是文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率高，特別是針對(duì)cfDNA樣本的建庫(kù)實(shí)驗(yàn)。但此方法操作比較繁瑣，新手很難達(dá)到其官方宣傳的建庫(kù)效率。

圖2. Swift法建庫(kù)流程圖

轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)技術(shù)的核心是Tn5轉(zhuǎn)座子，Tn5轉(zhuǎn)座子是一段含有若干抗性基因和編輯轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段，是一種細(xì)菌轉(zhuǎn)座子，最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)。NGS文庫(kù)構(gòu)建即把DNA樣本片段化或篩分成指定長(zhǎng)度的目標(biāo)序列，再加上寡核苷酸接頭P5、P7（和條形碼Barcode），用于后續(xù)測(cè)序上機(jī)。傳統(tǒng)建庫(kù)方式需經(jīng)過(guò)DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接、文庫(kù)擴(kuò)增、多次純化分選等步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)，將Tn5用于測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，可將DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?步反應(yīng)，極大縮短建庫(kù)時(shí)間，提高工作效率。

Tn5用于NGS建庫(kù)的體外轉(zhuǎn)座要素包含：轉(zhuǎn)座子的末端序列、靶DNA、轉(zhuǎn)座酶（Tnp）和Mg2+（激活劑），轉(zhuǎn)座法建庫(kù)形成的文庫(kù)結(jié)構(gòu)如下：

圖3. 轉(zhuǎn)座法建庫(kù)文庫(kù)結(jié)構(gòu)

將P5、P7端部分接頭序列（Adapter 1/2）+轉(zhuǎn)座子末端序列設(shè)計(jì)合成供體DNA，Tnp識(shí)別轉(zhuǎn)座子末端形成帶有P5、P7端部分接頭的Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體（見(jiàn)下圖4）。該復(fù)合體識(shí)別受體DNA的靶序列（Target site），切斷受體DNA，并插入攜帶的供體DNA，形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1，一端帶有P7部分接頭Adapter 2的DNA，之后通過(guò)PCR加上Barcode以及接頭其余部分，形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫(kù)。

圖4. Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)用于文庫(kù)構(gòu)建

轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有快速“剪切、粘貼”、“復(fù)制、粘貼”的功能，已被創(chuàng)新應(yīng)用于NGS領(lǐng)域，如ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，利用高通量測(cè)序檢測(cè)轉(zhuǎn)座酶易接近的染色質(zhì)），LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的線性放大），單倍體分型，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)等，不僅高效簡(jiǎn)便，有效縮短N(yùn)GS樣本建庫(kù)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；焖贉y(cè)序，提高測(cè)序分辨率，同時(shí)能夠被靈活改造，應(yīng)用于更多的技術(shù)創(chuàng)新。

擴(kuò)增子建庫(kù)是指利用PCR反應(yīng)在待測(cè)DNA片段兩端加上接頭的方法，原理相對(duì)比較簡(jiǎn)單，只需要兩輪PCR和兩步純化就可以得到目標(biāo)區(qū)域的文庫(kù)（如圖5），其中第一步是含通用序列的引物與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，第二步通過(guò)PCR反應(yīng)連接測(cè)序接頭，使得構(gòu)建的文庫(kù)可以用于上機(jī)測(cè)序（圖6）。

圖5.擴(kuò)增子建庫(kù)的操作步驟

圖 6.擴(kuò)增子建庫(kù)的兩次PCR反應(yīng)

與其它建庫(kù)方法對(duì)比，擴(kuò)增子建庫(kù)通過(guò)定制引物Panel完成文庫(kù)構(gòu)建。在臨床背景下，擴(kuò)增子建庫(kù)方法可以針對(duì)疾病目標(biāo)基因進(jìn)行捕獲，提高目標(biāo)基因檢測(cè)的覆蓋度和測(cè)序深度，解釋臨床結(jié)果。相對(duì)于其他建庫(kù)方法來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增子方法建庫(kù)可以通過(guò)單次測(cè)序反應(yīng)檢測(cè)更多患者樣本，后期生信分析的任務(wù)大大減少，得到的數(shù)據(jù)更易于儲(chǔ)存和管理。

但是此方法的應(yīng)用還受到一些限制：

1）PCR擴(kuò)增子建庫(kù)應(yīng)用于全外顯子或全基因組建庫(kù)時(shí)，由于設(shè)計(jì)出的引物不能完全擴(kuò)增出所有的待測(cè)片段會(huì)導(dǎo)致最終的文庫(kù)覆蓋率較低。

2）當(dāng)擴(kuò)增子之間有重疊時(shí)，為了避免重疊部分產(chǎn)生的短擴(kuò)增子的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增的影響，需要有兩個(gè)或多個(gè)引物池，這樣就會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)流程復(fù)雜且增加成本。

3）多重PCR反應(yīng)中容易出現(xiàn)引物二聚體的積累，引物二聚體由彼此雜交的引物分子組成，多重PCR反應(yīng)中多對(duì)引物的存在大大提高了引物二聚體的形成機(jī)會(huì)，而引物二聚體的擴(kuò)增會(huì)大量消耗引物本身和體系中其他的原料，甚至有抑制所需DNA序列擴(kuò)增的效果。

平末端連接接頭的方法基于Ion Torrent平臺(tái)。與Illumina平臺(tái)類(lèi)似，Ion Torrent平臺(tái)的文庫(kù)構(gòu)建目的也是在片段化好的DNA片段兩端加上特定接頭，該方法一般包括4個(gè)步驟：DNA樣本片段化、末端修復(fù)，連接adapter（PI和A/P1和X），選擇性回收DNA片段，文庫(kù)PCR富集，純化PCR產(chǎn)物（見(jiàn)圖7）。

       圖7.平末端接頭連接建庫(kù)方法流程圖（Ion Torrent平臺(tái)）

在這里需要注意的是：在Ion Torrent平臺(tái)構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)油包水PCR種到測(cè)序柱子上，文庫(kù)中的X或A接頭是測(cè)序起始端，而P1接頭是是連到測(cè)序珠子的這一端。與Illumina通過(guò)采集熒光信號(hào)記錄記錄堿基序列的方法不同，Ion Torrent的測(cè)序是通過(guò)微環(huán)境中pH值短暫的下降被pH電極檢測(cè)到并且把測(cè)得的值傳給計(jì)算機(jī)記錄。

綜上，NGS建庫(kù)可以按照接頭加入目的片段的不同分為5種，其中TA克隆連接接頭建庫(kù)法應(yīng)用廣泛，適用于絕大多數(shù)樣本建庫(kù)，是目前商業(yè)化建庫(kù)方式的主流；Swift法與TA克隆連接接頭法類(lèi)似，操作上相對(duì)繁瑣，P5接頭和P7接頭是分兩步連接上的；轉(zhuǎn)座酶法只需1h 40min即可完成文庫(kù)構(gòu)建，可以節(jié)省大量的人力，但是在應(yīng)用上只適用于cDNA和全基因組等文庫(kù)的構(gòu)建，且轉(zhuǎn)座酶本身具有偏好性，對(duì)后續(xù)的測(cè)序質(zhì)量會(huì)有一定的影響；PCR擴(kuò)增子建庫(kù)是捕獲建庫(kù)的一種，適用于臨床背景下靶向基因的研究，平末端連接接頭建庫(kù)適用于Ion Torrent平臺(tái)，Ion Torrent市場(chǎng)占有率相對(duì)較低，所以此建庫(kù)方法應(yīng)用范圍相對(duì)較少（見(jiàn)下表）。

表 NGS 5種建庫(kù)方法比較