小翌最近被很多客戶問到如下問題，做RT-qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄之后測(cè)得的cDNA濃度低是什么原因？今天小翌就帶您全面解答這個(gè)問題。
1. 影響cDNA濃度的因素
一般我們?cè)u(píng)估核酸模板的質(zhì)量，需要從濃度、純度及完整性三方面進(jìn)行考量，但逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系，有cDNA、未完全逆轉(zhuǎn)錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會(huì)干擾cDNA的吸光度，因此不建議用逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA來檢測(cè)濃度與純度。此外，260nm是核酸吸收峰最高的位置，在這個(gè)位置，1OD（optical density，光密度）的吸光度分別相當(dāng)于50ng/μl的雙鏈DNA，37ng/μl的單鏈DNA，40ng/μl的RNA，30ng/μl的寡核苷酸（dNTP）。就拿里面的dNTP來說，即使cDNA濃度一樣，但dNTP也會(huì)嚴(yán)重干擾其測(cè)定結(jié)果。
為此我們專門進(jìn)行了驗(yàn)證，可以進(jìn)一步說明dNTP 投入量對(duì)cDNA濃度檢測(cè)結(jié)果存在的影響。以小鼠肌肉組織RNA為模板，采用Yeasen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒11121ES（dNTP 組分按 1μl / 1.5μl /2μl /2.5μl添加量的梯度檢測(cè)）、T品牌、V品牌試劑分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，RNA 投入量為500ng，逆轉(zhuǎn)錄體系及程序分別按各自說明書進(jìn)行。采用Nanodrop測(cè)定cDNA濃度，并取相同體積cDNA分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：
不同品牌逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的cDNA濃度相差較大，但定量實(shí)驗(yàn)Ct值幾乎一致。
逆轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會(huì)使cDNA濃度的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致。
表1. Nanodrop定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
產(chǎn)品 | 濃度（ng/μl） |
Yeasen 11121ES+ dNTP 1μl | 916.864/ 920.295 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 1.5μl | 1247.707/ 1235.671 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 2μl | 1603.601/ 1592.303 |
Yeasen 11121ES+ dNTP 2.5μl | 1784.639/ 1780.047 |
T品牌 | 756.293/ 759.956 |
V品牌 | 1055.075/ 1055.137 |
dNTP（10mM）1μl | 9477.6/9488.6 |
圖1.qPCR檢測(cè)結(jié)果△Ct＜1，且 Ct 值與 Nanodrop 定量結(jié)果無線性關(guān)系
因此，cDNA濃度的測(cè)定值是不準(zhǔn)確的，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)之后無需測(cè)定濃度。RT-qPCR是一個(gè)多步驟連貫實(shí)驗(yàn)，正是因?yàn)閏DNA無法鑒定，只能通過后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)才能呈現(xiàn)結(jié)果，那如何去盡可能保證可以得到一份高質(zhì)量的cDNA，從而保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行呢？
2. 如何獲取高質(zhì)量的cDNA
作為RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的第一步，RNA的質(zhì)量直接決定定量結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。要獲得一份高質(zhì)量的RNA模板，可從以下幾方面進(jìn)行優(yōu)化。
1) 樣品處理與保存
新鮮采取的樣本可進(jìn)行液氮速凍或用一些特定的RNA樣品儲(chǔ)存液進(jìn)行處理，能立即保護(hù)樣品中的RNA，并滅活內(nèi)源RNase。樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)儲(chǔ)存在-80°C，不能進(jìn)行解凍，否則將導(dǎo)致RNA的降解和損失。而用RNA樣品儲(chǔ)存液進(jìn)行處理的樣品，保存條件則相對(duì)寬泛，長(zhǎng)期保存可置于-20°C以下，短期保存可置于4°C。
2) RNA提取
RNA的提取方式分為柱式提取和非柱式提?。ㄈ鏣rizol）。柱式提取法去除蛋白及其他雜質(zhì)干凈，提高了RNA的純度，但非柱式提取的方法RNA的得率則相對(duì)較高。環(huán)境中的RNase幾乎是無所不在，所以在整個(gè)RNA提取與后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄過程中，用到的吸頭、離心管、移液器、各種溶液、工作臺(tái)等等，必須確保無RNase污染。除去傳統(tǒng)的DEPC浸泡法，還能加以使用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑來進(jìn)行處理。
3) RNA儲(chǔ)存
純化的RNA應(yīng)溶于無RNase的水中儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度在-20°C或以下。最好將核酸模板分裝成小份保存以減少反復(fù)凍融。模板解凍完全后輕彈混勻后再使用。
4) RNA逆轉(zhuǎn)錄
①選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄引物
逆轉(zhuǎn)錄引物選擇指南 | ||||
特征 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 結(jié)合方式 | |
Oligo (dT) | 1）12-20個(gè)T； 2）與真核生物mRNA的3’ Poly A尾配對(duì)。 | 可合成全長(zhǎng)cDNA。
| 1）僅擴(kuò)增有poly A尾的mRNA； 2）對(duì)模板質(zhì)量要求高。 |
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Random Primers | 1）6-9個(gè)堿基； 2）可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合。 | 適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板。 | 特異性低，小片段多。 |
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基因特異性引物（GSP） | 識(shí)別特定模板序列。 | 特異性強(qiáng)，靈敏度高。 | 僅合成特定的序列，不適合研究同一個(gè)樣本中多個(gè)基因。 |
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②選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄酶
對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇，目前科研領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶主要有AMV， MMLV，以及基于這兩種酶改造的其他逆轉(zhuǎn)錄酶。Yeasen Hifair酶經(jīng)過分子改造后，缺失了MMLV原有的RNase H活性，避免了模板RNA的降解；同時(shí)具有更高的反應(yīng)溫度，針對(duì)一些高GC含量，以及富含復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板具有更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄效率。
圖2. Hifair酶缺失了RNase H活性，對(duì)復(fù)雜模板具有更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄效率
掌握了以上要點(diǎn)，終于不用糾結(jié)cDNA濃度了吧？
小翌在此給大家介紹下翌圣的逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)產(chǎn)品。
翌圣逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品選擇指南
小翌強(qiáng)烈推薦Hifair? Ⅲ Reverse Transcriptase，該酶具有逆轉(zhuǎn)錄效率出色、延伸性能優(yōu)越、RNA線性檢測(cè)范圍廣等優(yōu)勢(shì)，助力您合成高質(zhì)量的cDNA。
① 出色的逆轉(zhuǎn)錄效率，適合不同 GC 含量、不同表達(dá)豐度的基因
圖3.以300ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板, 使用11141ES、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff UNICON? Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴(kuò)增20個(gè)不同GC含量（25-65%）、不同表達(dá)豐度的基因。
② 優(yōu)越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
圖4. 以500ng 293T細(xì)胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用11139ES合成cDNA。 取1μL cDNA為模板，使用Hieff? Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)擴(kuò)增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder。
③ 線性檢測(cè)范圍廣，Total RNA 10pg-5μg
圖5. 以10pg-5μg的293T細(xì)胞的總RNA為模板，使用11141ES合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON? Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴(kuò)增PTTG1基因。
翌圣逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品榮登過的高分雜志（部分）
1. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
2. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
3. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
4. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
5. Tao L, Yi Y, Chen Y, et al. RIP1 kinase activity promotes steatohepatitis through mediating cell death and inflammation in macrophages[J]. bioRxiv, 2020.( IF10.717)
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