核酸濃度的測(cè)定是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中一項(xiàng)常規(guī)的定量實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)核酸濃度可以幫助我們?cè)诮酉聛淼南嚓P(guān)實(shí)驗(yàn)中確定酶和其它試劑的用量（比如：載體酶切實(shí)驗(yàn)、NGS建庫實(shí)驗(yàn)），或者排除核酸在實(shí)驗(yàn)中的干擾（比如：慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)），從而達(dá)到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
核糖核酸（RNA）含磷量約為9.5%，脫氧核糖核酸（DNA）含磷量約為9.2%，采用定磷法可準(zhǔn)確測(cè)出磷含量，進(jìn)而折算出樣品中核酸含量。
原理：在酸性條件下，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，當(dāng)還原劑存在時(shí)磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色的還原產(chǎn)物——鉬藍(lán)；鉬藍(lán)最大的剛吸收在650-660nm波長處，根據(jù)吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定核酸的濃度。測(cè)定范圍在1-10μg
優(yōu)缺點(diǎn)：簡單、快速；但易受蛋白與核苷酸的影響。
原理：核糖中的戊糖可在濃鹽酸或者濃硫酸作用下脫水生成醛類化合物可與某些成色劑縮合成有色化合物，可用比色法或者分光光度法測(cè)定其溶液中的吸收值，在一定的濃度范圍內(nèi)，溶液的吸收值與核酸的含量成正比。
RNA濃度的測(cè)試：RNA與濃鹽酸共熱時(shí)發(fā)生降解，產(chǎn)生的核糖又可轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛與3，5-二羥基甲苯（苔黑酚）反應(yīng)形成綠色復(fù)合物，生成的綠色化合物在670nm處有最大的吸收值。測(cè)定范圍在20~250μg
DNA濃度的測(cè)定：脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，生成的藍(lán)色的化合物在595nm處有最大吸收值。測(cè)定范圍在20~250 μg
優(yōu)缺點(diǎn)：較靈敏，但特異性較差
組成核酸分子的堿基，由于含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，具有紫外吸收的特性。吸收值在波長250-270nm之間，最大吸收波長是260nm。一般1μg/ml?RNA溶液在1cm光徑比色皿中的光吸收峰值約為0.022，1μg/ml?DNA溶液的光吸收值為0.020。因此測(cè)定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。
優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡便，迅速，只試用于測(cè)定濃度大于0.25ng/ul，無法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸及其它雜質(zhì)
專門配套的熒光檢測(cè)技術(shù)，只有與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光的染料。這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時(shí)才能發(fā)出熒光信號(hào)，采用熒光染料檢測(cè)特定目標(biāo)分子的濃度，可以對(duì)DNA和RNA進(jìn)行精準(zhǔn)定量。
優(yōu)缺點(diǎn)：靈敏，簡便；價(jià)格昂貴
使用熒光定量方法中的絕對(duì)定量，配套標(biāo)準(zhǔn)品，制作對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用熒光定量儀，計(jì)算對(duì)應(yīng)的熒光值并轉(zhuǎn)換對(duì)應(yīng)的核酸濃度。
優(yōu)缺點(diǎn)：靈敏度高，誤差小；操作時(shí)間長
隨著技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，核酸檢測(cè)越來越趨向于簡便的操作、較高的靈敏度、極高的準(zhǔn)確性。
紫外吸收法是目前實(shí)驗(yàn)室使用最多的核酸檢測(cè)方法同時(shí)也是目前核酸檢測(cè)最快速的方法，代表儀器：Nanodrop，特點(diǎn)是操作簡單，迅速，可以在2-3min出結(jié)果；
熒光光度法是目前包括高靈敏度和快速檢測(cè)的首選方法，代表儀器：Qubit，準(zhǔn)確度較高，可在5min之內(nèi)出結(jié)果；
qPCR法是目前靈敏度最高的核酸檢測(cè)方法，主要用于較低的核酸濃度檢測(cè)。
方法 | 定糖法 | 定磷法 | 紫外吸收法 | 熒光光度法 | qPCR法 |
原理 | 醛類化合物顏色反應(yīng) | 磷含量折算 | 芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的紫外吸收 | 特異性染料結(jié)合 | 熒光定量 |
檢測(cè) | 分光光度計(jì) | 分光光度計(jì) | 分光光度計(jì)/Qubit | 熒光定量儀 | |
靈敏度 | 1-10μg | 20~250μg（RNA） 20~400μg（DNA） | 大于0.25ng/ul | 0.2-100ng | 低至fg級(jí)別 |
優(yōu)點(diǎn) | 簡單，高濃度核酸檢測(cè) | 簡單，高濃度核酸檢測(cè) | 操作簡便，迅速 | 靈敏度較高 | 靈敏度高，適合批量檢測(cè) |
缺點(diǎn) | 易受蛋白與核苷酸的影響 | 特異性差 | 特異性較差 | 價(jià)格昂貴 | 操作時(shí)間長 |
應(yīng)用 | 高濃度核酸檢測(cè) | 高濃度核酸檢測(cè) | 常規(guī)核酸濃度檢測(cè) | 低濃度核酸檢測(cè) | 低濃度核酸檢測(cè) |
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?
——千真萬確，精益求精
本產(chǎn)品是用于lllumina?平臺(tái)高通量測(cè)序文庫濃度絕對(duì)定量的專用試劑盒，提供定量所需的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、qPCR Master Mix、定量擴(kuò)增引物和參比染料ROX。qPCR Master Mix是基于抗體法熱啟動(dòng)的染料法qPCR預(yù)混液，可在不同長度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴(kuò)增。
》準(zhǔn)確度高：精準(zhǔn)定量測(cè)序文庫，提高測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量
》試用范圍廣：精確有效的定量不同長度、不同GC含量的文庫
》使用簡便：包含ROX，方便qPCR儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化
》產(chǎn)品穩(wěn)定性：嚴(yán)格質(zhì)控，批次間穩(wěn)定性CV≤5%
訂購信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | 1526 |
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, DNA Standard |
相關(guān)產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
12640ES60/76 | 100/500 T | 686/2696 |
