他山之石，可以攻玉！接下來小翌帶領(lǐng)大家一起解決實(shí)驗(yàn)開展前后的可能遇到的各種困惑。
01
實(shí)驗(yàn)開展前，“千頭萬緒”
1、DNA文庫構(gòu)建方法的選擇：為什么酶切法建庫如此備受青睞？
酶切法構(gòu)建DNA文庫，相較于傳統(tǒng)的超聲法和轉(zhuǎn)座酶法具有以下優(yōu)勢：
無偏好片段化酶：具有穩(wěn)定的片段化效果，無需復(fù)雜的機(jī)械片段化過程。酶切產(chǎn)物片段大小同樣本類型、Input DNA量和GC含量等均無相關(guān)性，僅與酶切時間有關(guān)。
建庫流程精簡：一步完成片段化/末端修復(fù)/加A ，片段化/末端修復(fù)/加A （30min）-接頭連接（15min）-純化/分選（30min）-文庫擴(kuò)增（15min）-純化分選（30min），常規(guī)建庫預(yù)計(jì)耗時約2h，PCR-free建庫預(yù)計(jì)耗時1h。
寬泛的樣本投入范圍：相比較固定投入量，固定酶切時間的TN5建庫，酶切法建庫適用500 pg-1 μg，滿足個性化建庫。
圖1.翌圣Onepot系列酶切法建庫優(yōu)勢
2. 酶切法建庫運(yùn)用的是什么酶，類似限制性酶切酶嗎，具體如何打斷DNA呢？
不同于限制性酶切酶，片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶，不受特定酶切位點(diǎn)的限制，隨機(jī)切割對應(yīng)模板DNA，片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端，后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。
舉例：投入500 pg-1000 ng的正常人類基因組DNA，30 ℃ 15min, 可將DNA酶切為150-550 bp左右的長度。
3. 酶切法建庫適合哪些應(yīng)用研究嗎，對樣本具有普適性嗎？
片段化酶酶切法建庫可適用全基因組測序（含PCR-free文庫構(gòu)建）、全外顯子測序、靶向捕獲測序、宏基因組測序等。適合樣本類型是gDNA、cDNA和高質(zhì)量的FFPE樣本等，不適合cfDNA（cfDNA無需打斷）。
4、酶切法建庫試劑盒針對哪些樣本建庫效果比較好？
兼容范圍為500 pg – 1μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。基因組DNA和cDNA均可獲得高產(chǎn)高質(zhì)的文庫。
舉例：
展示為翌圣onepot II系列12204應(yīng)用于cDNA文庫構(gòu)建（ds-cDNA）
背景：客戶得到逆轉(zhuǎn)錄的ds-cDNA，全長1.1kb左右，想酶切至300 bp左右。
結(jié)論：Input DNA 50 ng左右，酶切4-10 min，PCR 8Cycles，產(chǎn)量>3μg,若需要更集中的文庫，可進(jìn)行雙輪分選。
5、對于不同類型的DNA樣本，酶切時間如何控制？
對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時間如下：
當(dāng)然了，為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，建議在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)。
02
實(shí)驗(yàn)開展后，“五味陳雜”
6、gDNA片段化參考說明書酶切條件酶切20 min，竟然切不動？
一般優(yōu)先考慮DNA的質(zhì)量問題，比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子，可能會影響酶切效果，建議將DNA稀釋在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進(jìn)行片段化。其次，如果樣本是反轉(zhuǎn)錄得到的全長cDNA，則需考慮樣本純度問題。另外，對于環(huán)狀DNA的酶切，需要另行摸索酶切時間體系。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進(jìn)行酶切或適當(dāng)延長酶切時間。
備注：紅色曲線表示，30度酶切20 min未切開
7、FFPE樣本，酶切時間太難控制了？
眾所周知，F(xiàn)FPE樣本雖然使組織得以長期保存，但其特殊的制作方法和保存過程對核酸分子造成多方面的影響：核酸與蛋白交聯(lián)、降解嚴(yán)重等諸多問題。我們先來看下不同質(zhì)量的FFPE樣本，采用相同的酶切條件影響有多大。
舉例：相同酶切條件下，質(zhì)量高的樣本酶切效果較好，滿足需求（樣本4），質(zhì)量差的樣本出現(xiàn)過度酶切現(xiàn)象，酶切片段偏小（樣本1/3）。
備注：FFPE樣本DNA質(zhì)量也可通過瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡單判斷，高質(zhì)量樣本-DNA質(zhì)量大于10kb，條帶明亮單一，建議酶切10 min左右；一般質(zhì)量樣本-膠圖顯示無明顯主帶，整體彌散條帶，建議酶切6-8 min；質(zhì)量較差樣本-膠圖無主帶，整體條帶弱，建議酶切2 min；極差FFPE樣本，建議可不酶切，搭配FFPE修復(fù)試劑直接建庫。
8、DNA酶切后出現(xiàn)大片段殘留？
酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大片段殘留現(xiàn)象，考慮Input DNA純度外（參考FAQ 6），建議適當(dāng)延長酶切時間。
9、酶切時間也不長，竟然過度酶切了?
以插入片段300 bp為例，白細(xì)胞gDNA，30 度酶切10min，出現(xiàn)如下圖過度酶切現(xiàn)象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小，如白細(xì)胞gDNA較小，應(yīng)適當(dāng)縮短酶切時間，否則易出現(xiàn)如下過度酶切現(xiàn)象。
10、酶切法建庫，如何做到較好的質(zhì)量控制？
1）文庫濃度檢測，qubit法或qPCR ；
2）文庫長度檢測，瓊脂糖凝膠電泳測定；
3）文庫質(zhì)量鑒定，Agilent 2100/2200；
4）文庫大小分布、引物二聚體和過擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失，應(yīng)通過電泳方法進(jìn)行確認(rèn).
構(gòu)建優(yōu)異的DNA文庫，除了明確以上因素之外，還需要選擇高質(zhì)量的建庫產(chǎn)品。翌圣生物為滿足廣大科研工作者的NGS建庫實(shí)驗(yàn)需求，推出了NGS建庫整體解決方案，方便大家根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。
HB200623
