提起傳統(tǒng)酶切連接克隆或載體構(gòu)建，什么讓大家苦不堪言？
小A：每次都要糾結(jié)于各種限制性內(nèi)切酶的選擇。
小B：操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，至少需三四天才能完成。
小C：每次只能克隆1個(gè)目的片段。
小D：片段結(jié)合位置上有時(shí)會(huì)留下“疤痕”。
忘記苦難，今天小編給大家介紹一種新的克隆方法 —— 一步法同源重組技術(shù)，帶你們脫離苦海！
一步法同源重組技術(shù)是一種利用同源序列重組的原理，進(jìn)行無縫克隆的技術(shù)。該技術(shù)無需考慮酶切位點(diǎn)，幾乎適用于任何載體與任何片段的定向克隆。操作過程簡(jiǎn)單快速，只需50℃，20min即可完成反應(yīng)。勁爆的是，多個(gè)片段也可以同時(shí)一次完成克隆哦！
激動(dòng)寶寶小C：如此厲害，是如何做到呢？
【秘】一步法同源重組技術(shù)的關(guān)鍵在于同源重組酶。它兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性及連接酶活性。
外切酶活性：該酶活性能特異性地識(shí)別載體和插入片段末端的15-20bp的同源序列，并沿著5'至3'方向，切割雙鏈DNA，從而產(chǎn)生粘性末端，粘性末端的堿基在50℃作用下進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，將具備同源序列的載體與插入片段“融合”。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將片段和載體的5'末端都降解成一樣長(zhǎng)的粘性末端，同源末端退火配對(duì)后，還存在單鏈的堿基缺口。此時(shí)需要借助DNA聚合酶活性進(jìn)行修復(fù)。
連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口縫合，實(shí)現(xiàn)無“疤痕”拼接，即無縫克隆。
好奇寶寶小D：外切酶降解雙鏈DNA多長(zhǎng)呢？是否會(huì)把雙鏈DNA切割成單鏈導(dǎo)致無法進(jìn)行片段重組呢？
莫擔(dān)心，一步法同源重組自有妙招！一步法同源重組的重組反應(yīng)溫度是50℃，遠(yuǎn)高于外切酶的最適溫度。此外，外切酶的含量較低，故重組反應(yīng)體系中很快會(huì)失去外切酶活性。對(duì)于200bp以上的雙鏈DNA片段都是完全不用擔(dān)心的。
心急寶寶小B：這么牛逼的一步法同源重組，快給我們講講怎么操作吧。
1.制備載體
需將線性化載體制備好，既可以選擇酶切，也可以選擇PCR的方式制備線性化載體。
2.設(shè)計(jì)目的片段引物
在目的片段上下游引物的5'端引入15-25bp左右載體末端同源序列。
3.擴(kuò)增目的片段
通過PCR的方法，使目的片段的兩端加上了與載體末端相應(yīng)的同源序列.
4.重組反應(yīng)
按比例混合線性化載體和目的片段，50℃反應(yīng)20 min。
5.轉(zhuǎn)化，鑒定
將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板，挑取克隆進(jìn)行陽性鑒定。
機(jī)智寶寶小A：一步法同源重組有啥應(yīng)用呢？
一步法同源重組可以應(yīng)用于定點(diǎn)突變，CRISPR，構(gòu)建多順反子表達(dá)載體等等。
