DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)、也是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的5-甲基胞嘧啶(5mC)是研究最多的修飾堿基，它在從基因調(diào)控到正常發(fā)育的廣泛生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是第五個(gè)堿基。5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是由5mC經(jīng)過(guò)TET家族酶氧化而來(lái)，在神經(jīng)元細(xì)胞含量較高，被認(rèn)為是第六堿基。
DNA甲基化修飾在維持正常細(xì)胞的功能、雌性個(gè)體X染色體失活、寄生DNA序列的抑制、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、遺傳印記、胚胎發(fā)育、及腫瘤和疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，具有至關(guān)重要的作用。5mC可以導(dǎo)致基因沉默或基因表達(dá)水平降低，因此，腫瘤抑癌基因的過(guò)甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。而5hmC作為去甲基化過(guò)程的第一步，則會(huì)導(dǎo)致基因激活或基因表達(dá)水平增高，研究表明DNA的5hmC在多種腫瘤中有明顯降低。因此，分析基因組的5mC和5hmC水平具有重要的臨床意義。WGBS（Whole-genome bisulfite sequencing）被視為甲基化測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要檢測(cè)5mC和5hmC兩種修飾形式。在此基礎(chǔ)上衍生出了的一些方法用來(lái)區(qū)分5mC和5hmC，比如氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序（oxBS-seq）被用于5mC特異性測(cè)序，以及TET輔助的重亞硫酸鹽測(cè)序(TAB-seq)特異性檢測(cè)5hmC。近年來(lái)，基于酶法轉(zhuǎn)化的甲基化測(cè)序技術(shù)不斷涌現(xiàn)出來(lái)，APOBEC偶聯(lián)甲基化表觀測(cè)序 (ACE-seq）可以特異性檢測(cè)5hmC，以及酶法甲基化測(cè)序(EM-seq)可同時(shí)檢測(cè)5mC和5hmC。TAPS技術(shù)一改之前將未發(fā)生甲基化修飾的C轉(zhuǎn)化未U的方法，創(chuàng)新性的實(shí)現(xiàn)了正向檢測(cè)甲基化位點(diǎn)的測(cè)序技術(shù)，其衍生技術(shù)TAPSβ及CAPS，亦可實(shí)現(xiàn)5mC和5hmC的區(qū)分，具有巨大的潛力。該技術(shù)在將傳統(tǒng)的BS-Seq技術(shù)與化學(xué)氧化相結(jié)合，先利用高釕酸鉀KRuO4將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒(méi)有任何修飾的C就被轉(zhuǎn)化成U，而5mC則不會(huì)被轉(zhuǎn)化，仍然保持為C。如此則可以特異性的檢測(cè)5mC，BS-Seq和oxBS-Seq聯(lián)合測(cè)序也可實(shí)現(xiàn)對(duì)5hmC單堿基分辨率的檢測(cè)。其技術(shù)原理示意圖如下（圖1）：圖1.oxBS-seq 5mC單堿基分辨率測(cè)序（Booth, M. J. et al.2012, Science）TET輔助的重亞硫酸鹽測(cè)序(TAB-seq)
用糖基把羥甲基化的C給保護(hù)起來(lái)，然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C轉(zhuǎn)化成羥基化的C，進(jìn)一步將羥甲基化的C轉(zhuǎn)化成甲?；腃和羧基化的C。甲?；腃和羧基化的C都可以被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成U。而之前被糖基化保護(hù)起來(lái)的羥甲基化的C，是不會(huì)被TET蛋白轉(zhuǎn)化成甲?；腃或者羧基化的C的。在亞硫酸氫鹽的處理過(guò)程中，它還保持是C。并且在之后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，也表現(xiàn)為C。這樣，就可以把羥甲基化的C和甲基化的C給區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而特異性的檢測(cè)5hmC。其技術(shù)原理示意圖如圖（圖2）：圖2.TAB-seq 5hmC單堿基分辨率測(cè)序 (Yu, M. et al. 2012, Cell)APOBEC偶聯(lián)甲基化測(cè)序(ACE-seq)
不同于傳統(tǒng)的BS-Seq，該技術(shù)使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學(xué)脫氨，保證了DNA的完整性。首先，利用T4 β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（βGT）將5hmC轉(zhuǎn)化成5ghmC，5ghmC不會(huì)被A3A酶脫氨基，這樣A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變?yōu)閁，而5ghmC則因?yàn)椴槐辉撁缸R(shí)別，測(cè)序時(shí)仍被檢測(cè)為C。這樣，可將5hmC與C及5mC區(qū)分開(kāi)來(lái)，實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)5hmC。該技術(shù)原理示意圖如下（圖3）：圖3.ACE-seq 5hmC單堿基分辨率測(cè)序(Schutsky, E. K. et al. 2018, Nat. Biotechnol)全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）長(zhǎng)期以來(lái)一直是甲基化圖譜分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但重亞硫酸鹽的化學(xué)反應(yīng)會(huì)破壞和降解DNA，導(dǎo)致DNA斷裂和丟失?；诿阜ǖ募谆瘻y(cè)序就克服了這個(gè)缺點(diǎn)。Enzymatic Methyl-seq（EM-seq）通過(guò)酶法完成WGBS建庫(kù)，其對(duì)DNA的酶處理分為兩步：第一步使用TET2酶以及氧化增強(qiáng)劑將5mC和5hmC氧化成5caC，保護(hù)經(jīng)過(guò)修飾的胞嘧啶；第二步利用脫氨酶APOBEC對(duì)胞嘧啶進(jìn)行脫氨處理，此步驟不會(huì)對(duì)5caC造成影響，從而實(shí)現(xiàn)5mC和5hmC的檢測(cè)。其技術(shù)原理示意圖如下（圖4）：
圖4.EM-seq 單堿基分辨率測(cè)序(Vaisvila, R. et al.2020, bioRxiv)TET輔助吡啶硼烷測(cè)序（TAPS）(TET-assisted pyridine borane sequencing)、TAPSβ及CAPS
在TAB-seq中講到TET蛋白可以把甲基化的C轉(zhuǎn)化成羥基化的C，進(jìn)一步將羥甲基化的C轉(zhuǎn)化成甲?；腃和羧基化的C。TAPS技術(shù)發(fā)現(xiàn)5caC可以被吡啶硼烷及衍生物（Pyridine borane）還原為二氫尿嘧啶（dihydrouracil，DHU），而DHU在鏈擴(kuò)增方面與自然的U堿基并沒(méi)有差異，這樣經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增DHU可以轉(zhuǎn)化為T(mén)，從而到達(dá)不用亞硫酸鹽處理將甲基化的C堿基轉(zhuǎn)為T(mén)堿基的目的。TAPS得到的DNA文庫(kù)復(fù)雜度高（僅把占比很小的甲基化C進(jìn)行了改變，對(duì)DNA的天然序列改變很小，堿基平衡），避免了bisulfite法引起的DNA損傷及文庫(kù)的不平衡，對(duì)Illumina測(cè)序儀更加友好，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。TAPS的衍生方法TAPSβ及CAPS可分別用于檢測(cè)5mC和5hmC。TAPSβ也是用糖基化酶把羥甲基化的C給保護(hù)起來(lái)，使其免受TET氧化。再使用TET酶將甲基化的C轉(zhuǎn)化羥甲基化的C在轉(zhuǎn)化成甲?；腃和羧基化的C。5caC則可在吡啶硼烷還原為二氫尿嘧啶，而被保護(hù)起來(lái)的羥甲基化的C則不變。經(jīng)過(guò)后續(xù)步驟測(cè)序則可特異性的區(qū)分5mC。CAPS技術(shù)仍利用利用了oxBS-seq中高釕酸鉀KRuO4將DNA上的5hmC氧化成5fC，經(jīng)吡啶硼烷的衍生物（pic-borane）5fC還原成二氫尿嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)特異性的檢測(cè)5hmC。該系列技術(shù)原理示意圖如下（圖5）：
圖5.TAPS、TAPSβ、CAPS 單堿基分辨率測(cè)序(Liu, Y. et al.2021, Nat Commun)
以上就是幾種對(duì)于5mC和5hmC測(cè)序方法，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，甲基化檢測(cè)技術(shù)將在癌癥早期診斷及篩查領(lǐng)域有更廣闊的發(fā)展前景。產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
Hieff NGS? Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina? | 12211ES08 | 8T |
12211ES24 | 24T |
12211ES96 | 96T |
Hieff Canace? 耐U+高保真DNA聚合酶 | 10145ES60 | 100 U |
10145ES76 | 500 U |
[1] Booth, M. J. et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science 336, 934–937 (2012).
[2] Yu, M. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 149, 1368–1380 (2012).
[3] Schutsky, E. K. et al. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat. Biotechnol. 36,1083–1090 (2018).
[4] Vaisvila, R. et al. EM-seq: detection of DNA methylation at single base resolution from picograms of DNA. Preprint at bioRxiv https://doi.org/ 10.1101/2019.12.20.884692 (2020).
[5] Liu, Y., Hu, Z., Cheng, J. et al. Subtraction-free and bisulfite-free specific sequencing of 5-methylcytosine and its oxidized derivatives atbase resolution. Nat Commun 27;12(1):618(2021).
