隨著各種基因組測(cè)序項(xiàng)目的完成，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，但多數(shù)基因功能不明，故研究基因的功能十分重要。分子克隆是基因功能研究中基礎(chǔ)和關(guān)鍵的內(nèi)容。利用分子克隆技術(shù)將外源基因插入質(zhì)粒載體，進(jìn)行外源基因的表達(dá)可能不是一件難事。但要同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因時(shí)，傳統(tǒng)的方法可能就比較困難。下面給大家介紹一種多個(gè)外源基因表達(dá)的方法——構(gòu)建多順反子表達(dá)載體。
今天我們以EGFRvIII基因、P2A多順反子元件、iRFP720基因插入到pLVX-TetOne載體中為例，介紹如何利用傳統(tǒng)酶切酶連技術(shù)和同源重組技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建多順反子表達(dá)載體。
粘性末端克隆
使用傳統(tǒng)酶切酶連法進(jìn)行克隆時(shí)，首先需要分析酶切位點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)只有AgeI和BstZ17I兩個(gè)酶切位點(diǎn)可用于EGFRvIII基因克隆，因?yàn)榱硗鈨蓚€(gè)酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI同時(shí)存在于EGFRvIII基因的內(nèi)部，導(dǎo)致無法使用。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處于同一個(gè)讀碼框，又導(dǎo)致無法使用AgeI酶切位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的克隆。針對(duì)這種酶切位點(diǎn)無法選擇的情況，我們可以選擇不需要考慮酶切位點(diǎn)的同源重組技術(shù)。
一步法克隆
使用同源重組技術(shù)無需考慮載體的酶切位點(diǎn)，只需在目的片段特異性上、下游引物5’端引入與線性化載體末端同源序列（15-25bp）即可。
1.制備線性化載體：可以用PCR或酶切的方式得到線性化的pLVX-TetOne載體。（最好膠回收純化）
2.目的基因的引物設(shè)計(jì)：EGFRvIII上游引物、RFP720下游引物分別與線性化的pLVX-TetOne載體具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之間也有15-25bp的同源序列。（這里要提到的是，P2A元件很短，僅有66 bp，有可能被重組酶中的外切酶徹底降解。我們可以通過兩輪PCR，在擴(kuò)增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可獲得P2A + iRFP重組片段。對(duì)于這種目的基因過短的情況，可以采取這種方式。）
給大家安利一款同源重組引物設(shè)計(jì)軟件：
http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/
軟件使用特別方便，只要在左側(cè)選擇載體線性化方式以及插入的片段數(shù)，根據(jù)網(wǎng)頁填寫基本信息點(diǎn)擊生成引物，最后就可以獲得完整插入DNA片段的上下游引物啦，快快收藏起來吧！
3. 目的基因的擴(kuò)增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三個(gè)基因的擴(kuò)增。（最好膠回收純化）
4. 重組反應(yīng)：將EGFRvIII，P2A及iRFP720三個(gè)基因同時(shí)插入到pLVX-TetOne載體中。
5.轉(zhuǎn)化：將重組反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)細(xì)胞中。
6.克隆鑒定：通過菌落PCR，雙酶切或測(cè)序鑒定陽性克隆。
7. 表達(dá)：轉(zhuǎn)到表達(dá)感受態(tài)中進(jìn)行表達(dá)。實(shí)現(xiàn)Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)EGFRvIII基因，同時(shí)還能表達(dá)iRFP720基因，用于小動(dòng)物活體熒光成像。
