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      首頁(yè) / 單細(xì)胞測(cè)序 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情
       
      干貨|單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)與胚胎植入前遺傳學(xué)診斷
       
      人類輔助生殖技術(shù)快速發(fā)展，幫助不育患者實(shí)現(xiàn)生育的愿望，同時(shí)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷有效降低了后代患遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)。從培養(yǎng)的胚胎中取出個(gè)別卵裂球細(xì)胞、極體或滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)分析選擇正常的胚胎移植，但單個(gè)細(xì)胞的基因組DNA含量通常在pg級(jí)別，無(wú)法滿足各大測(cè)序平臺(tái)的要求，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)（whole genome amplification，WGA）成為了首要解決超低量樣本的方式之一。

      該技術(shù)可在單細(xì)胞的水平上對(duì)全基因組進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增，盡可能減少擴(kuò)增偏好性，獲得準(zhǔn)確的、均一性良好的、高覆蓋度的擴(kuò)增基因組序列。目前已有多種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)，下面就和小翌一起看看這些技術(shù)吧！

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      圖1.常用WGA技術(shù)


      基于熱循環(huán)PCR的技術(shù)

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      PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）

      技術(shù)原理：使用~15bp的完全隨機(jī)引物在37℃的低退火溫度下進(jìn)行退火，然后逐漸將溫度升至55℃進(jìn)行引物延伸，退火和引物延伸的時(shí)間都相對(duì)較長(zhǎng)。

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      DOP-PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR）

      技術(shù)原理：使用部分簡(jiǎn)并引物隨機(jī)結(jié)合在單細(xì)胞基因組上，使用多個(gè)退火溫度和延伸溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)隨機(jī)擴(kuò)增全基因組序列。

      兩者區(qū)別在于PEP-PCR使用的引物為完全隨機(jī)寡核苷酸引物，而DOP-PCR的引物為簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，為部分隨機(jī)引物，同時(shí)DOP-PCR的退火溫度的設(shè)計(jì)也有所不同，DOP-PCR有多個(gè)退火溫度與延伸溫度，在最初幾個(gè)循環(huán)中的退火溫度較低（~25℃），確保引物盡可能的結(jié)合到基因組模板上，而之后的循環(huán)中則采用相對(duì)更高的退火溫度（~55℃）繼而進(jìn)行PCR反應(yīng)。與PEP-PCR相比，DOP-PCR在引物和PCR參數(shù)的設(shè)計(jì)上進(jìn)行了嚴(yán)格的優(yōu)化升級(jí)，一定程度上提升了擴(kuò)增的準(zhǔn)確度和基因組覆蓋度，但仍然有較高的錯(cuò)誤率。

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      LM-PCR（ligation-mediated PCR）

      技術(shù)原理：使用限制性內(nèi)切酶在基因組相應(yīng)位置上隨機(jī)切斷單細(xì)胞基因組 DNA，然后在末端引入擴(kuò)增引物，再通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。該方法擴(kuò)增效率高，但步驟較多，且對(duì)于高GC等復(fù)雜結(jié)構(gòu)區(qū)域的序列容易出現(xiàn)擴(kuò)增偏差。

      總之，以熱循環(huán)PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，均會(huì)引入一些錯(cuò)誤，主要取決于聚合酶的保真性，另外由于引物或限制性內(nèi)切酶以及堿基擴(kuò)增的偏好性會(huì)使得全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋度不足。此類技術(shù)可應(yīng)用于SNP/STR分型；1M bin size水平上的檢測(cè)，DOP-PCR也可用于對(duì)染色體的CNV進(jìn)行定量。不太適用于檢測(cè)基因突變，假陽(yáng)性率較高。

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      圖2.基于熱循環(huán)PCR的WGA技術(shù)


      基于等溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)

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      多重置換擴(kuò)增技術(shù)MDA（multiple displacement amplification）

      技術(shù)原理：使用隨機(jī)的六聚體引物和phi29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，可擴(kuò)增產(chǎn)生50~200kb的DNA片段，可用于構(gòu)建大片段文庫(kù)，同時(shí)該酶還能以新合成的DNA子鏈為模板，繼續(xù)合成新的DNA子鏈，擴(kuò)增產(chǎn)量高，同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對(duì)活性，phi29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性，準(zhǔn)確性更高、基因組覆蓋度更高，適用于SNV分析，但仍具有一定的基因組區(qū)域偏好性，這種偏好性是隨機(jī)的難以重復(fù)，因此對(duì)CNV分析有一定影響。另外MDA擴(kuò)增對(duì)樣本的完整性要求較高，對(duì)不完整的DNA擴(kuò)增效率較低，因此MDA不太適用于固定后的樣本。

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      圖3.MDA 全基因組擴(kuò)增技術(shù)


      多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)MALBAC

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      MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）

      技術(shù)原理：該技術(shù)將 PCR 和 MDA 技術(shù)聯(lián)合，同時(shí)兼顧了單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的保真度和均一性。亮點(diǎn)在于擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’含有8bp的隨機(jī)序列，該引物在低溫下與模板結(jié)合，先經(jīng)過(guò)幾個(gè)循環(huán)的多重鏈置換反應(yīng)后，形成完整的擴(kuò)增產(chǎn)物兩端會(huì)引入互補(bǔ)的序列，使得新擴(kuò)增的DNA分子形成一個(gè)loop結(jié)構(gòu)而無(wú)法被作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，而原始的基因組DNA鏈和Semiampilicon則可繼續(xù)作為模板鏈進(jìn)行擴(kuò)增，一定程度上減小了指數(shù)擴(kuò)增帶來(lái)的偏好性。

      MALBAC第一輪擴(kuò)增利用多重置換反應(yīng)提高擴(kuò)增產(chǎn)物的全基因組覆蓋度，并在一定程度上保證了擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確定，再結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)增，提升產(chǎn)物的準(zhǔn)確率的同時(shí)保證均一性，但在模板拷貝數(shù)極低時(shí)易擴(kuò)增偏差，可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，有一定的錯(cuò)誤率，但是這種錯(cuò)誤在不同的細(xì)胞中是可重復(fù)的，因此可以通過(guò)后期識(shí)別這種錯(cuò)誤，避免假性結(jié)果。

      總的來(lái)說(shuō)，MALBAC技術(shù)兼具高保真性和高基因組覆蓋度，可用于SNV檢測(cè)和CNV檢測(cè)，可以同時(shí)用于新鮮樣本和固定后樣本的全基因組擴(kuò)增。目前也是輔助生殖中廣泛采用的技術(shù)之一。

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      圖4.MALBAC WGA技術(shù)

      胚胎植入前用來(lái)做 PGD 的樣本通常為極體或囊胚期單細(xì)胞，能夠用于檢測(cè)的 DNA 含量很少，并且能夠檢測(cè)的靶點(diǎn)比較少。單細(xì)胞基因組高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展大大提高了PGD 檢測(cè)成功率，全基因組擴(kuò)增技術(shù)基本解決了單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的問(wèn)題，盡管也有很多不足，但技術(shù)的不斷更新和改善，減少了諸如擴(kuò)增偏好性、擴(kuò)增假象、覆蓋度不足、錯(cuò)誤率等問(wèn)題，使其越來(lái)越滿足臨床檢測(cè)需求。

      翌圣近期將推出單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒，提供單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方案，助力輔助生殖領(lǐng)域，敬請(qǐng)期待！


      參考文獻(xiàn)

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