每次做MTT實驗，結(jié)果一次一個樣，實驗重復(fù)性那么差，這樣的實驗數(shù)據(jù)怎么能發(fā)表……

看到糾結(jié)的童鞋，小翌也是深有同感，數(shù)據(jù)不準確，文章很頭疼，怎么辦？

不用擔(dān)心，師兄最近剛安利了一款新型的細胞增殖和活性檢測試劑CCK-8，可以完全解決實驗重復(fù)性差的問題。

現(xiàn)在讓小翌來評測對比下CCK-8和MTT的誰才是王者~

 

原理PK
 

CCK-8：是WST-8在電子耦合載體1-Methoxy PMS存在的情況下被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物（formazan）。通過酶標儀測量細胞液的OD值便可檢測出待測細胞樣品的活性。

   
 

CCK-8細胞活性檢測原理圖

 

MTT: 是利用活細胞的線粒體脫氫酶在代謝過程中將黃色的可溶性四唑鹽MTT還原為不溶于水的藍紫色產(chǎn)物-甲臜(Formazan)晶體。使用合適的溶解液如DM SO溶解沉積在細胞中的甲臜晶體，通過酶標儀測量細胞液的OD值便可檢測出待測細胞樣品的活性。

 

 

 

 

MTT胞活性檢測原理圖

操作流程PK： 
 

 

CCK-8和MTT操作流程圖

 

使用MTT法進行活力檢測時，生成的甲臜產(chǎn)物需要用DMSO溶解，顆粒不完全溶解或者在吸取上清操作過程中帶走部分細胞等情況，往往會導(dǎo)致實驗結(jié)果穩(wěn)定性查、重復(fù)性差等一系列問題，有的期刊可能質(zhì)疑數(shù)據(jù)的正確性。

CCK-8生成的甲臜產(chǎn)物是水溶性的，可直接測定OD值，不存在不完全溶解和產(chǎn)物被帶走的情況，可以完全避免MTT法在操作上帶來的誤差。

 

下面分享幾點小翌師兄進行CCK8細胞活力檢測的經(jīng)驗。

1.起始細胞接種數(shù)量：以使用標準96孔板為例，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果檢測白細胞，靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。

2.CCK-8加入劑量：一般建議為按培養(yǎng)體系的10%添加，添加過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

3.細胞孵育時間：孵育時間一般為1-4小時，一般懸浮細胞孵育的時間要長于貼壁細胞，由于CCK-8的OD值處在1.0左右是比較好的檢測結(jié)果，建議實驗者可以每隔0.5h測定一次OD值，以摸索出最佳孵育時間。

4.檢測波長：如果沒有450 nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度高。

5.CCK-8對細胞的毒性：CCK-8毒性非常低，檢測完后相同的細胞可以繼續(xù)進行其它細胞增殖檢測，如結(jié)晶紫染色法、中性紅染色法或DNA熒光染色法等。