進行基礎研究或應用科學研究，多少會涉及到質(zhì)粒工具，這些質(zhì)粒無論是自己構建還是別人饋贈或者公司購買前后，我們要盡可能做到知其然知其所以然，便于知悉獲得的質(zhì)粒是否適用于研究目的。

通過這篇文章，嘗試解決：如何快速知道質(zhì)粒上的各種元件并了解我的質(zhì)粒是否適用于我的實驗，如何通過元件解讀質(zhì)粒的提取、質(zhì)粒轉染甚至宿主中的表達和篩選問題？

 

一、質(zhì)粒的工具屬性-強大的運載工具
 

實驗研究中的質(zhì)粒是人為改造的重組質(zhì)粒，改造之處是以天然質(zhì)粒或簡單質(zhì)粒骨架為基礎量體裁衣式地改變大小、重新改編序列組成。除具備自主復制外，質(zhì)?？刹僮餍院凸δ苄愿鼜?，更具工具屬性。

 

1、克隆質(zhì)粒
 

能在宿主細胞中復制擴增，用于測序和保存外源基因。這類載體具有簡單的組成基本元件（ori，Ampr/Kanar,MCS）,沒有啟動子等啟動轉錄、翻譯的元件。

 

2、基因（過）表達質(zhì)粒

除克隆載體的基本元件外，還具有啟動子等啟動轉錄/翻譯所必需的DNA序列。

 

3、基因敲除/敲降質(zhì)粒
 

 

用于靶向基因敲除和定點編輯。含有目標基因的識別序列或目標基因mRNA的shRNA，實現(xiàn)切斷目標基因或mRNA降解，起到基因表達沉默的效果，下調(diào)蛋白表達。

 

二、具備上述屬性的源頭——作用元件的存在
 

1.復制起始位點Ori
 

被宿主細胞復制因子所識別，利用宿主的復制機器，復制，增加拷貝數(shù)。因宿主復制機器不同，可分為原核/真核/穿梭質(zhì)粒。

 

2.抗性基因

 

 

質(zhì)粒轉化是一個效率極低的過程，平均約10000個細胞中有1個細胞轉化成功。想象一下，如果沒有抗性基因的存在，篩選出陽性克隆的時間將大大延長。并且，外源性存在的質(zhì)粒要進行復制等活動，會消耗宿主細胞自身的資源，在沒有抗生素的培養(yǎng)基中，帶有質(zhì)粒的細胞不占優(yōu)勢，慢慢消失；在抗生素的存在情況下，抗性基因幫助宿主細胞分解抗生素，細胞才會需要質(zhì)粒。

 

 

3.多克隆酶切位點

 

 

決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。商業(yè)化的質(zhì)粒大多已人為地改造添加多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。

 

 

4.標簽蛋白/報告基因

 

 

常見的標簽如6×His、Myc、GST等；常用到的報告基因如β-半乳糖苷酶、GFP、熒光素酶等。

 

 

5.表達系統(tǒng)元件

 

 

即啟動子（Promoter）-核糖體結合位點（RBS）-轉錄終止信號-增強子。這是用來區(qū)分克隆載體與表達載體的?？寺≥d體中加入一些表達系統(tǒng)元件即成為表達載體。對于質(zhì)粒發(fā)揮作用，至關重要！

 

啟動子：是RNA聚合酶結合位點，位于基因表達框的上游。啟動子序列控制RNA聚合酶與轉錄因子的結合，因此對于DNA何時何地轉錄至關重要。因宿主RNA聚合酶種類不同，質(zhì)粒中的啟動子類型也有所不同。

核糖體結合位點：一般為AUG（起始密碼子）。也常常會有SD序列，在起始密碼子上游5-10bp處，同16s rRNA 3＇端互補。

轉錄終止信號：結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，下游有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。細菌表達質(zhì)粒常見的終止子如T7，哺乳動物細胞質(zhì)粒常見的終止子如SV40、SV40 late polyA、BGH等。

增強子：為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。

 

三、質(zhì)粒的選擇——如何根據(jù)實驗目的，選擇合適的質(zhì)粒

 

對作用元件做了簡單的介紹后，我們進一步從實驗角度理解這些元件如何服務于我們的實驗。質(zhì)粒選擇前，我們先想到的是看質(zhì)粒圖譜，其實也就是思考選擇作用元件的過程。

 

 

1.元件的選擇

 

第一步，根據(jù)實驗目的區(qū)別選擇克隆載體還是表達載體。

 

第二步，看懂復制起始位點（Ori），Ori是決定質(zhì)粒拷貝數(shù)和宿主類型的重要參數(shù)。

l 控制質(zhì)粒拷貝數(shù)：Ori對于復制的控制，可分為松弛型和嚴謹型。松弛型質(zhì)粒在細菌內(nèi)的復制不受控制，拷貝數(shù)＞10個拷貝，嚴謹型質(zhì)粒＜10個拷貝。常見的Ori如ColE1和pBR322等，屬于松弛型。

l 決定質(zhì)粒共轉染：相同類型的Ori質(zhì)粒在同一個宿主細胞內(nèi)不兼容。相同的Ori質(zhì)粒使用相同的復制機器，易引起宿主細胞環(huán)境的不穩(wěn)定。因此，兩質(zhì)?；蚨噘|(zhì)粒共轉染時，需注意質(zhì)粒的Ori是否兼容。

l 決定在何種宿主內(nèi)存在：根據(jù)Ori類型，可以將載體分為原核質(zhì)粒、真核質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒。其中穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。

第三步，篩選抗生素的選擇?？蓞⒖妓拗黝愋?，下面列舉一些常見的抗性篩選基因。

第四步，酶切位點的選擇。如果進行蛋白表達，注意避免閱讀框移位。

第五步，注意選擇合適的標簽蛋白或標記基因。

第六步，讀懂表達作用元件，最大程度激發(fā)質(zhì)粒功能！質(zhì)粒上攜帶的各類基因唯有表達為蛋白，才能發(fā)揮作用。1）啟動子方向性：我們看質(zhì)粒圖譜，會發(fā)現(xiàn)順時針和逆時針兩類箭頭，這是基因表達的方向。啟動子是在靶基因的上游位置。2）啟動子特異性：真核生物常見的啟動子如CMV、EF1α、SV40，原核生物常見的如T7啟動子。

 

2.幾點注意事項

 

關于宿主與啟動子的選擇：必須搭配對應的啟動子，方能啟動基因的表達。如neo抗性基因可以消除G418、卡那霉素的作用，在pET-28a質(zhì)粒中，neo基因的啟動子可以在大腸桿菌啟動抗性基因的表達，用于卡那霉素的篩選，但不能在真核生物中用于G418的篩選；在酵母載體pPIC9K中，攜帶的neo基因可以用于大腸桿菌卡那霉素和酵母G418篩選。

 

關于質(zhì)粒載量：復制子復制能力有限，插入片段越大，會造成質(zhì)粒不穩(wěn)定，同時復制困難。

關于拷貝數(shù)：并不是越多越好。質(zhì)粒復制借助于宿主，拷貝數(shù)越多，宿主消耗越嚴重，對宿主影響越大。

HB180720