瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳，簡稱核酸電泳，是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法，常用于DNA 切膠回收，DNA 分離和用于佐證DNA 是否重組、質(zhì)粒等是否切開。
瓊脂糖凝膠電泳的分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。作為分子篩的瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，不同大小的DNA分子帶電情況不同，在電場中受力也不同，因此從負(fù)極向正極遷移的速度不同。大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。
如何跑好瓊脂糖凝膠電泳？這3項(xiàng)必備：瓊脂糖、核酸染料、DNA marker。
● 瓊脂糖——雖然我不甜，但還是想要你寵我
瓊脂糖（Agarose）是純化的線性半乳聚糖親水膠體，提取自瓊脂或者含瓊脂的海藻，結(jié)構(gòu)上是一種線性聚合物，由β-D-吡喃半乳糖（1-4）連接3,6-脫水α-L-吡喃半乳糖基構(gòu)成。瓊脂糖的基本參數(shù)，包括：
1) 硫酸鹽含量（sulfate content）——純度指標(biāo)；
2）凝膠強(qiáng)度（gel strength）——施加于凝膠使之?dāng)嗔训耐饬Γ?br />
3）膠凝點(diǎn)（Gel point）——水溶性瓊脂糖溶液冷卻后形成凝膠時的溫度；
4）電內(nèi)滲（EEO）——液體穿透凝膠的一種電動運(yùn)動。瓊脂糖凝膠內(nèi)的陰離子基團(tuán)吸附在基質(zhì)上不會發(fā)生遷移，但是解離的陽離子就會朝負(fù)極遷移，從而產(chǎn)生電滲。由于生物聚合物的電泳遷移通常是朝負(fù)極運(yùn)動，則EEO產(chǎn)生的內(nèi)部對流會干擾分離效率。
注：圖示為翌圣瓊脂糖10208ES60產(chǎn)品展示圖。
所以，根據(jù)瓊脂糖的基本參數(shù)，可靠的瓊脂糖凝膠應(yīng)該膠孔清晰、膠體不易斷，具備純度高（硫酸鹽含量低）、凝膠強(qiáng)度大、膠凝點(diǎn)相對高（常溫條件下凝固快）、電內(nèi)滲低等特點(diǎn)。不同大小的目的片段也對應(yīng)著不同大小的瓊脂糖濃度，根據(jù)高濃度適合分離小片段原則，可參考下表找到合適自己的最佳膠濃度。
● 核酸染料——無毒無公害，核酸盡顯形
瓊脂糖凝膠電泳必然離不開核酸染料的加持，溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）是應(yīng)用最早的、最成熟的核酸染料，并且由于其價格便宜、靈敏度高，早期被實(shí)驗(yàn)者廣泛應(yīng)用。但其分子量小，很輕易就能穿透細(xì)胞膜，屬于誘變劑，具有高致癌性，對人體潛在危害非常大。實(shí)驗(yàn)者使用時需要謹(jǐn)慎再謹(jǐn)慎，另外，單獨(dú)的EB區(qū)占用了實(shí)驗(yàn)室的大塊空間，廢膠、廢液的處理費(fèi)時、費(fèi)力又費(fèi)錢，以及不小心碰到EB區(qū)的東西可能再也不能重見天日了，真是讓人又愛又恨。
隨著技術(shù)的發(fā)展，人們對健康與環(huán)境安全的重視，無毒核酸染料應(yīng)運(yùn)而生。
那么，市面上宣稱的無毒核酸染料真的無毒么？除了無毒還有什么優(yōu)勢呢？ 帶著這些問題，可以參考翌圣YeaRed，一款替代EB的安全無毒核酸染料，來作為選擇依據(jù)。
YeaRed是翌圣生物研發(fā)的一種新型無毒核酸染料，具有獨(dú)特的油性大分子結(jié)構(gòu)，不能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不易揮發(fā)升華，人體不會吸入，從而保證了實(shí)驗(yàn)者安全。另外，YeaRed核酸染料進(jìn)行了Mini-Ames試驗(yàn)，檢測結(jié)果為陰性，即在凝膠染色濃度下YeaRed核酸染料無毒性。（具體檢測報告可向我公司技術(shù)咨詢）
產(chǎn)品性能測試
圖1. 核酸染料YeaRed的瓊脂糖凝膠電泳圖。電泳條件：120 V，30 min。樣品為2000 DNA Marker，1-5上樣量分別為1-5 uL。
客戶反饋
★復(fù)旦大學(xué)
圖2. 核酸染料YeaRed的瓊脂糖凝膠電泳圖。電泳條件：120 V，30 min。Marker：DS2000。目的片段：550 bp。
★中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所
圖3. 核酸染料YeaRed的瓊脂糖凝膠電泳圖。電泳條件：150 V，30 min。2%瓊脂糖膠。 Marker：2000 DNA Marker。目的片段：350 bp。
● DNA Marker——瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)尺
DNA Marker是分子量不同的DNA片段的組合，主要用途為DNA分子凝膠電泳時，與樣品共同加入凝膠中進(jìn)行電泳分離，通過樣品條帶與DNA Marker對應(yīng)條帶大小及亮度的對比，可以粗略估算樣品DNA分子量的大小以及在溶液中的濃度。
目前翌圣生物DNA Marker分子量大小范圍覆蓋了從50 bp到15 kb的DNA片段，符合絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需求。
產(chǎn)品特點(diǎn)
1、穩(wěn)定性強(qiáng)，可在室溫保存3-6個月；
2、背景干凈、帶型穩(wěn)定、大小精準(zhǔn)；
3、含指示帶，各條帶濃度已知，便于定位及半定量分析；
4、已含上樣緩沖液，可直接電泳，方便快捷；
5、附有5×loading buffer，可供樣品加樣使用。
使用翌圣核酸電泳系列產(chǎn)品已發(fā)表的部分文獻(xiàn)
[1]. Liu C, Zou G, et al. 5-Formyluracil as a Multifunctional Building Block in Biosensor Designs[J]. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Jul 26;57(31):9689-9693.（IF 11.992）
[2]. Lin Q, Ye X, Yang B, et al. Real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive detection of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus associated with colorectal cancer[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2019, 411(26): 6877-6887.（IF6.35）
[3]. Lin Q, Ye X, Huang Z, et al. Graphene Oxide-Based Suppression of Nonspecificity in Loop-Mediated Isothermal Amplification Enabling Sensitive Detection of Cyclooxygenase-2 mRNA in Colorectal Cancer[J]. Analytical chemistry, 2019.（IF6.35）
[4]. Wang W, Nie A, Lu Z, et al. Catalytic hairpin assembly-assisted lateral flow assay for visual determination of microRNA-21 using gold nanoparticles[J]. Microchimica Acta, 2019, 186(9): 661.（IF5.479）
[5] Cheng H, Fan X, et al. Cyclodextrin-Based Star-Like Amphiphilic Cationic Polymer as a Potential Pharmaceutical Carrier in Macrophages[J]. Macromol Rapid Commun. 2018 May 28:e1800207.（IF 4.441）
FAQ
Q：為什么跑出的條帶彌散？
A：可能凝膠時間過短，膠不均勻。1%的瓊脂糖最少凝膠時間為 30min。
Q：高分辨瓊脂糖能夠分開多大的條帶？
A：高分辨率瓊脂糖和3:1瓊脂糖的分辨率均為 2%左右（即片段30bp的話，則能分開30*0.02；100bp片段則100*0.02。）
Q：低熔點(diǎn)瓊脂可以用來做脈沖場凝膠電泳嗎？
A：不可以，脈沖場凝膠電泳要求是電滲要很低，強(qiáng)度要很高。
Q：低熔點(diǎn)瓊脂糖是不是無菌無核酸酶的？其他類型的瓊脂糖呢？
A：無菌無核酸酶，低熔點(diǎn)瓊脂糖常用來做細(xì)胞空斑實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)可放心使用。其他類型的瓊脂糖也是無菌的，無核酸酶的。
Q：瓊脂糖會比較軟，這個是什么原因？
A：軟硬和凝膠強(qiáng)度有關(guān)，瓊脂糖都是瓊脂提取物，強(qiáng)度高低都是會有一定差異的，不可能每一批都相同。瓊脂糖的強(qiáng)度指標(biāo)是大于等于1200，只要在這個范圍以上就是合格的。
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相關(guān)產(chǎn)品訂購信息
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
規(guī)格 |
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瓊脂糖 |
10208ES60 |
100 g |
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無毒核酸染料 |
10202ES76 |
500 μL |
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DNA Marker |
10501ES60 |
100 T |
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10504ES60 |
100 T |
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10505ES60 |
100 T |
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10507ES60 |
100 T |
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10510ES60 |
100 T |
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10511ES80 |
1 ml |
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10512ES60 |
100 T |
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10515ES60 |
100 T |
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10516ES60 |
100 T |
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10517ES60 |
100 T |
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10518ES60 |
100 T |
