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巨噬細胞的清除，是全面了解巨噬細胞在病理條件下功能的一種十分有力的研究方法，氯膦酸鹽脂質(zhì)體（Clodronate Liposomes）是目前最為成熟，方便，經(jīng)濟的一種巨噬細胞清除工具，可以有效的清除動物體內(nèi)不同組織部位和血液中的巨噬細胞。

 

氯膦酸鹽脂質(zhì)體組成及原理

 

氯膦酸二鈉（Clodronate）是一種雙膦酸鹽藥物，在臨床上主要用于癌癥引起的溶骨性骨轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)疏松癥和高鈣血癥。其作用機理是氯膦酸二鈉在細胞內(nèi)代謝成不可水解的ATP類似物，抑制線粒體中的ADP/ATP轉(zhuǎn)運機制，從而阻斷線粒體呼吸鏈誘導(dǎo)細胞凋亡。但是該藥物親脂性低，不能跨細胞轉(zhuǎn)運，在口服或是靜脈給予游離藥物后，2小時后即可達半衰期，48小時內(nèi)80%藥物隨尿液排出。

脂質(zhì)體是單層或多層脂質(zhì)雙分子層的球形囊泡，其主要成分是磷脂和膽固醇。脂質(zhì)體本身具有雙分子層結(jié)構(gòu)，組成成分無毒性，因此可以作為運輸分子物質(zhì)的載體，它通過與細胞膜結(jié)合的方式將分子物質(zhì)運輸?shù)郊毎麅?nèi)。

 

圖1：氯膦酸-脂質(zhì)體（Clodronate liposomes）復(fù)合物

 

氯膦酸鹽包裹進磷脂體的水相中形成氯膦酸鹽脂質(zhì)體，氯膦酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體磷脂體雙分子層。注射到生物體內(nèi)后，氯膦酸鹽脂質(zhì)體會被巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞內(nèi)的溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體內(nèi)的氯膦酸鹽會被逐步釋放出來并在細胞內(nèi)積累，當(dāng)達到一定濃度時，巨噬細胞將會受到不可逆損傷，誘發(fā)細胞凋亡。死亡細胞內(nèi)的氯膦酸鹽會被釋放到細胞外，隨尿液排出體外。

圖2：巨噬細胞清除劑原理示意圖

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

1 mL脂質(zhì)體體懸液中所含的氯膦酸大約為5 mg，脂質(zhì)體直徑為1.5-2μm。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na₂HPO₄，10 mM NaH₂PO₄，140 mM NaCl。

 

使用要點

 

» 必須使用無菌操作從小瓶中取出產(chǎn)品，如果無菌性受損，請勿使用。

» 當(dāng)靜置超過幾個小時后，脂質(zhì)體可能會沉淀，在使用之前，為了確保脂質(zhì)體懸浮液均勻，緩慢倒轉(zhuǎn)小瓶數(shù)次，直到懸浮液均勻，不要劇烈搖晃或震動。

» 在注射氯膦酸脂質(zhì)體后數(shù)小時內(nèi)，動物免疫能力開始下降，注意動物健康狀況，以防止與實驗無關(guān)的感染。

» 如果研究使用免疫缺陷小鼠預(yù)計會有很高的死亡率。

» 靜脈給藥時，請將藥物加熱至室溫（18 ℃），并去除注射器中的氣泡，緩慢注射，如果動物表現(xiàn)出任何異常反應(yīng)，請降低注射速度。

» 脂質(zhì)體應(yīng)保存在4 °C，切勿冷凍。

 

體內(nèi)注射方案（僅供參考）

 

尾靜脈注射方法：

» 將小鼠固定，拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側(cè)的靜脈；

» 將紗布浸泡于約70 ℃溫水中，拿出后包裹尾巴，使尾部血管擴張并軟化表皮角質(zhì)；

» 尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進針。開始注入藥物時應(yīng)緩慢，仔細觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入藥物。

» 如需連續(xù)尾靜脈注射給藥，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血。

【注】：以上操作方法和劑量使用僅供參考，不同的實驗請自行設(shè)計實驗方案或是參考相關(guān)文獻。

 

效果展示

參考案例一 »

圖3： 左圖是正常小鼠肝臟免疫細胞中Kupffer細胞的比例，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時后Kupffer細胞的比例，可以看到Kupffer細胞基本被清除^[1]。

 

 

參考案例二 »

圖4： 上圖是小鼠LLC細胞肺癌成瘤實驗中正常腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），可以看出腫瘤中的巨噬細胞基本被清除^[2]。

 

不同組織巨噬細胞清除的實驗方法 »

靶向器官/細胞	實驗方法
脾臟/紅髓區(qū)巨噬細胞	單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
肝臟/Kupffer細胞	單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
肺/肺泡巨噬細胞	靜脈注射（150-200 μL）聯(lián)合氣管或鼻內(nèi)（50 μL）給藥獲得最佳效果
淋巴結(jié)	注射（100-200 μL）/小鼠，具體給藥方式可參考文獻
腦/小膠質(zhì)細胞	腦室腦脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠

【注】：本劑量僅供參考，請根據(jù)實驗需求使用或參考文獻。

FAQ

Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作？

A:收到氯膦酸脂質(zhì)體后，如果不能馬上使用，需要放置在4 ℃冰箱。禁止凍存！使用時作為原液使用，不能進行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4 ℃的氯膦酸脂質(zhì)體不能馬上使用，需要恢復(fù)到室溫才能進行注射。

Q2:如何將脂質(zhì)體從小瓶中轉(zhuǎn)移出來？

A:從小瓶中轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的最佳方法是使用無菌針頭注射器。這樣小瓶中剩余的脂質(zhì)體懸浮液就可以保持密封和清潔。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進行轉(zhuǎn)移，但最好在潔凈的環(huán)境中進行，例如在BSC罩中。

Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細胞清除？

A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細胞的清除，但是這種方法比較適合體內(nèi)實驗。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中，從死亡細胞釋放的氯膦酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏”出來氯膦酸，會一直存在于培養(yǎng)基中，但是在體內(nèi)，氯膦酸的半衰期很短，很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯膦酸不會進入細胞也不會進入脂質(zhì)體，但是一旦他們在培養(yǎng)基中積累就會慢慢地進入細胞中。

Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了，是什么原因？

A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時間后會發(fā)生沉降。如果在很長一段時間內(nèi)需要一次注射多只動物，那么脂質(zhì)體便會在注射器中發(fā)生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，第一只注射的計量與最后一只注射的計量就會發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后，沒有恢復(fù)到室溫。

Q5:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？

A：這個可能是受到細菌的污染，體內(nèi)清除巨噬細胞后會增加例如病毒粒子，細菌或者酵母感染的幾率。

Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細胞并沒有完全消失？

A：大鼠中成熟的巨噬細胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細胞也是ED1+，但是呈現(xiàn)ED2-。因此，所有ED2+的細胞都可以被完全清除，但是ED1+的細胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細胞的比例。

Q7: Clodronate liposomes沒有達到期望的效果？

A：氯膦酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn)，每批次都會對氯膦酸的濃度以及一些可能的污染物進行檢測，確保無誤后才會銷售給客戶。另外，脂質(zhì)體容易收到極端溫度的影響。正確的運輸和儲存方式是4~8 ℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30 ℃。自收到貨物起，需要在3個月內(nèi)使用完，不然有可能會影響使用的效果。

Q8:在靜脈注射時，能不能增加注射的體積？

A：靜脈注射時需要依據(jù)動物的體重，不能超過0.1 mL/10 mg，但是進行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點的容量進行決定。

Q9:使用脂質(zhì)體應(yīng)注意的一些事項？

A：通過具有飽和烴鏈的脂質(zhì)制備而來的脂質(zhì)體實際上非常堅固，但仍需要注意以下一些事項。

①不要與有機溶劑混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、乙醚等。

②不要添加表面活性劑，除非您必須要這樣做以裂解脂質(zhì)體。

③不要加熱、接近或高于脂質(zhì)主相轉(zhuǎn)變溫度，除非進行藥物加載，這需要在相變溫度以上進行孵育。

 

產(chǎn)品訂購

 

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Clodronate Liposomes(From Vrije Universiteit Amsterdam) 體內(nèi)巨噬細胞清除劑	40337ES08	5 mL
	40337ES10	10 mL
Control Liposomes( PBS ) 體內(nèi)巨噬細胞清除劑空白脂質(zhì)體對照	40338ES08	5 mL
	40338ES10	10 mL

 

參考文獻

 

[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
 

[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.