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      巨噬細(xì)胞及其體內(nèi)外研究策略
       
      

      

      

      

      

      巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)介
      


       
      

      

      

      

      

      


      

      巨噬細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)可追溯到1882年，生物學(xué)家 Ellie Metchnikoff 在研究缺乏適應(yīng)性免疫機(jī)制的原始動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，并將這些細(xì)胞稱(chēng)為吞噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是具有異質(zhì)性的一群免疫細(xì)胞，具有高度可塑性，具有多種功能，包括組織發(fā)育和體內(nèi)平衡、清除細(xì)胞碎片、消除病原體和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。不同的誘導(dǎo)信號(hào)可激活巨噬細(xì)胞改變其自身的形態(tài)和生理特征。
      

      


      


      

      圖1. 巨噬細(xì)胞起源[1]
      


      

       
      

      


      借用輔助性T細(xì)胞(Th)的概念，從激活方式上將巨噬細(xì)胞激活狀態(tài)通常被簡(jiǎn)化為兩類(lèi)：經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages,CAMs或M1)和非經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages,AAMs或M2)兩大類(lèi)。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，抵抗病原入侵但也造成機(jī)體損傷；M2型分泌抗炎癥細(xì)胞因子，并在組織修復(fù)與重建和腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。
      


      

       
      


      圖2. 巨噬細(xì)胞的不同表型、細(xì)胞表面標(biāo)記和功能[2]
      

      

      


      

      值得注意的是，巨噬細(xì)胞的這兩種分型并沒(méi)有絕對(duì)意義上的對(duì)立區(qū)分，即M1和M2表型并非相互排斥，而是經(jīng)常共存的，因此不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為它們是完全不同的巨噬細(xì)胞群體。巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物通常在不同分型的巨噬細(xì)胞上以不同水平表達(dá)，并且不同分型的巨噬細(xì)胞在特定條件下能發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。在體內(nèi)傷口愈合中，巨噬細(xì)胞在早期階段表現(xiàn)出促炎 M1 分泌譜，高能力呈遞抗原、產(chǎn)生白細(xì)胞介素IL-12 和IL-23，抑制細(xì)胞增殖并造成組織損傷；在后期愈合階段，巨噬細(xì)胞則轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡?M2 基因表達(dá)譜，通過(guò)產(chǎn)生血管生成介質(zhì)，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，促進(jìn)炎癥消退和傷口愈合。
      

      


      


      

      圖3. 組織修復(fù)、再生和纖維化中主要巨噬細(xì)胞活化表型的機(jī)制[3]
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      體外研究
      

      

      

      

      

      


      

      巨噬細(xì)胞極化的體外研究，通常使用IFN-γ和LPS等TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)M1型極化，使用IL-4或IL-13等誘導(dǎo)M2型極化，然后檢測(cè)基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及蛋白質(zhì)含量和活性的變化。目前人巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)主要分為無(wú)限增殖的單核細(xì)胞系THP-1來(lái)源或者原代分離的單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)。
      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      體內(nèi)研究
      

      

      

      

      

      


      

      巨噬細(xì)胞是體內(nèi)每個(gè)器官中唯一都存在的細(xì)胞，存在于表皮、角膜和沒(méi)有血管的關(guān)節(jié)內(nèi)部，其體內(nèi)生物學(xué)研究的重要方法之一是巨噬細(xì)胞耗竭。體內(nèi)巨噬細(xì)胞耗竭是一種采用理化或遺傳學(xué)技術(shù)將巨噬細(xì)胞去除的方法。這種方法現(xiàn)已廣泛用于研究巨噬細(xì)胞在動(dòng)物疾病模型中的作用和免疫病理或炎癥損傷機(jī)制研究，如炎癥性疾病：過(guò)敏性哮喘、糖尿病、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫病相關(guān)的研究；以及其他領(lǐng)域疾病：腫瘤，病毒相關(guān)疾病，組織再生等相關(guān)的研究。氯膦酸鹽脂質(zhì)體法是目前最常用的巨噬細(xì)胞耗竭方法。
      

      


      

      

      

      

      

      體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑
      


       
      

      

      

      

      

      


      

      自從Nico van Rooijen教授利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制，將膜不通透性的氯磷酸（clodronate）帶入細(xì)胞內(nèi)，氯磷酸被釋放，當(dāng)達(dá)到一定的濃度時(shí)可引發(fā)巨噬細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的，成功開(kāi)發(fā)出一款Clodronate Liposomes體內(nèi)局勢(shì)細(xì)胞清除劑。該試劑作為目前世界上最為成熟，便捷的巨噬細(xì)胞清除工具被廣泛應(yīng)用。
      

      


      


      

      圖4.巨噬細(xì)胞清除原理示意圖
      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      產(chǎn)品性質(zhì)
      

      

      

      

      

      


      

      1 mL脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5 mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4，10 mM Na2HPO4，140 mM NaCl。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      體內(nèi)注射方案（僅供參考）
      

      

      

      

      

      


      

      隔日尾靜脈注射200 μL clodronate liposome，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制定注射日程，通過(guò)免疫組化或流式檢測(cè)巨噬細(xì)胞去除效率。
      

      


      

      

      

      

      

      

      

      

      

      


      

      尾靜脈注射方法流程
      

      


      

      

      


      

       
      

      


      

        
	
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        將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi)，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈，2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側(cè)的靜脈；
        
	
        • 
	
      • 
	
        將紗布浸泡于約70℃溫水中，拿出后包裹尾巴，以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的；
        
	
        • 
	
      • 
	
        行尾部靜脈注射時(shí)，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進(jìn)針，開(kāi)始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無(wú)阻力，無(wú)白色皮丘出現(xiàn)，說(shuō)明已刺入血管，可正式注入藥物。
        
	
        • 
	
      • 
	
        有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開(kāi)始，按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血。
        
	
        • 

      

      


      

       
      

      


      

      

      

      

      

      


      

      注：以上操作方法和劑量使用僅供參考，不同的實(shí)驗(yàn)要求需自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案或是參考相關(guān)文獻(xiàn)。
      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      不同組織巨噬細(xì)胞清除的實(shí)驗(yàn)方法 （僅供參考）
      

      

      

      

      

      


      

      
	
		
      
			
			
      靶向器官/細(xì)胞
      
			      		
			
			
      實(shí)驗(yàn)方法
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      脾臟/紅髓區(qū)巨噬細(xì)胞
      
			      		
			
			
      單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射）
      

			
      長(zhǎng)期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      肝臟/Kupffer細(xì)胞
      
			      		
			
			
      單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射）
      

			
      長(zhǎng)期耗竭：第一次給藥劑量200 μL/小鼠，之后每隔三天給藥200 μL/小鼠
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      肺/肺泡巨噬細(xì)胞
      
			      		
			
			
      靜脈注射（150-200 μL）聯(lián)合氣管或鼻內(nèi)（50 μL）給藥獲得最佳效果
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      淋巴結(jié)
      
			      		
			
			
      注射（100-200 μL）/小鼠，具體給藥方式可參考文獻(xiàn)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      腦/小膠質(zhì)細(xì)胞
      
			      		
			
			
      腦室腦脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠
      
			      		
		
      
	      

      

      


      

      

      注：本劑量?jī)H供參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求使用或參考文獻(xiàn)。
      

      


       
      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      效果展示
      

      

      

      

      

      


      

      參考案例一：
      

      


      


      

      圖5.左圖是正常小鼠肝臟免疫細(xì)胞中Kupffer細(xì)胞的比例，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時(shí)后Kupffer細(xì)胞的比例，可以看到Kupffer細(xì)胞基本被清除[4]。
      


       
      


      參考案例二：
      

      


      


      

      圖6.上圖是小鼠LLC細(xì)胞肺癌成瘤實(shí)驗(yàn)中正常腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光），下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光），可以看出腫瘤中的巨噬細(xì)胞基本被清除[5]。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      相關(guān)產(chǎn)品
      

      

      

      

      

      


      

       
      


      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品名稱(chēng)
      
			      		
			
			
      貨號(hào)
      
			      		
			
			
      規(guī)格
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam）
      
			體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑（推薦使用陰性對(duì)照40338ES08/10）
      
			      		
			
			
      40337ES08/10
      
			      		
			
			
      5 mL/10 mL
      
			      		
		
      
		
      
		
      
		
      
			
			
      Control Liposomes（PBS）
      
			體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑空白脂質(zhì)體對(duì)照
      
			      		
			
			
      40338ES08/10
      
			      		
			
			
      5 mL/10 mL
      
			      		
		
      
		
      
		
      
	      

      


      【注】40338體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑空白脂質(zhì)體對(duì)照是相對(duì)于40337體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑而言的，僅在制備的過(guò)程中沒(méi)有添加氯磷酸的成分，是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好的陰性對(duì)照。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      

      


      

      

      

      參考文獻(xiàn)
      

      

      

      

      

      


      

      [1] Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 2003;3(1):23-35. doi:10.1038/nri978
      


      [2] Wang LX, Zhang SX, Wu HJ, Rong XL, Guo J. M2b macrophage polarization and its roles in diseases. J Leukoc Biol. 2019 Aug;106(2):345-358. doi: 10.1002/JLB.3RU1018-378RR. Epub 2018 Dec 21. PMID: 30576000; PMCID: PMC7379745.
      


      [3] Chu S, Wang J, Gao F. The Application of Chitosan Nanostructures in Stomatology. Molecules. 2021 Oct 19;26(20):6315. doi: 10.3390/molecules26206315. PMID: 34684896; PMCID: PMC8541323.
      


      [4] Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
      


      [5] Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
      

      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883