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      常用報告基因有哪些種類？一文讀懂！
       
       
      


      

      

      

      

      

      

       
      

      


      什么是報告基因？
      


      

       
      

      

      

      

      

      


      

      報告基因( reporter gene) 是一種編碼在內(nèi)源蛋白背景下易被檢測出來的蛋白質(zhì)或酶的基因。報告基因與目的基因或調(diào)控序列相連，通過間接或直接檢測報告基因編碼產(chǎn)物的信號，比如報告蛋白、mRNA、酶等，直觀反映細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄活性或表達水平。一般報告基因的特點是無毒、無免疫原性、易于檢測、具有一定的特異性。報告基因編碼產(chǎn)物的半衰期是比較關(guān)注的一個關(guān)鍵點。編碼產(chǎn)物半衰期和報告基因的應用領(lǐng)域息息相關(guān)。[1]
      


       
      


      那么報告基因該如何選擇呢？在選擇報告基因時一般基于以下幾個原則，對宿主的影響，內(nèi)源性活性影響以及方法是否成熟等。目前報告基因大致分為四類[2][3]，不同的報告基因有著不同的優(yōu)缺點（表1）。下面就幾種不同的報告基因做出舉例介紹。
      

      


      

      表1.不同報告基因的優(yōu)勢和劣勢
      


      

      


      

       
      


       
      

      


      

      

      

      

      

       
      

      


      綠色熒光蛋白報告基因
      


      

       
      

      

      

      

      

      


      

      綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）來自維多利亞水母，是熒光蛋白中應用最多的一種。GFP可在508nm處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物。將GFP基因插入質(zhì)粒作為一種手段，可以達到許多功能目的。例如：GFP可作為報告基因用于檢測目的基因表達或調(diào)控，或作為融合標簽來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移或分子間的相互作用、靶向標記某些細胞器等等。GFP蛋白已經(jīng)變?yōu)樯锘瘜W和細胞生物學中最廣泛研究和利用的蛋白質(zhì)之一。圖1展示了GFP的蛋白模式圖以及GFP基因?qū)隫ero細胞后的鏡下圖。翌圣生物推出GFP報告基因質(zhì)粒，對載體中預測出的其它轉(zhuǎn)錄因子以外的結(jié)合位點進行了適當?shù)耐蛔?，增加了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特異性。另外，由于質(zhì)粒體積減小，使得報告基因更易于轉(zhuǎn)染。
      


       
      

      


      

      

      


      

      圖1.GFP報告基因。a展示的是GFP的蛋白結(jié)構(gòu)[1]。b展示經(jīng)過CMV-GFP改造過的腺病毒感染的VERO細胞鏡下圖.[3]
      


       
      

      


      

       
      


      

      

      

      

      

       
      

      


      氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告基因
      


      

       
      

      

      

      

      

      


      氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT）基因是一種細菌基因。細菌通過進化來中和抗生素氯霉素。CAT將乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素中，形成乙?；让顾?，從而將其改變?yōu)闊o害形式。如圖2，當CAT反應完成后，要進行酶測定，首先從細胞中提取蛋白質(zhì)，然后將該提取與用放射性氫合成的氯霉素（3H）混合。此外，底物乙酰輔酶A也被添加到混合物中。乙?；暮颗c存在的CAT酶的含量成正比。將產(chǎn)物置于薄層色譜（TLC）片上，置于適當?shù)娜軇确潞图状嫉幕旌衔铮┲?，其向上遷移暴露于X射線后被檢測。被乙?；穆让顾乜梢訶射線膠片上被看見。
      


       
      

      


      

      


      圖2.氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告基因。由于唯一的放射性分子是氯霉素，X射線膠片上唯一可見的分子是氯霉素及其所有乙?；问?/strong>
      


      1: promoter 1 construct; 2：promoter 2 construct;3：negative control; 4：positive control。
      

      


      

       
      


       
      

      


      

      

      

      

      

       
      

      


      熒光素酶報告基因
      


      

       
      

      

      

      

      

      


      

      在生物醫(yī)藥行業(yè)最主要的報告基因為熒光素酶報告基因。最常見的熒光素酶 （luciferase）基因來源于螢火蟲。熒光素酶在ATP、氧氣和Mg2+存在的條件下氧化熒光素，產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物可進行定量測定。相對于其他報告基因，螢光素酶具有諸多優(yōu)勢：檢測靈敏度高，如螢火蟲螢光素酶的檢測靈敏度可達 10-20 mol，靈敏度約為CAT 的 100 倍，信號半衰期可維持數(shù)小時；檢測范圍寬，可達 7-8 個數(shù)量級。[5]
      


       
      


      除此之外，不同物種中已經(jīng)鑒定出其他熒光素酶，它們的動力學、底物要求和光子發(fā)射波長各不相同。我公司產(chǎn)品應用中關(guān)于酶報告基因檢測系統(tǒng)的原理和應用有詳細介紹，可查看往期熒光素酶介紹。翌圣生物推出熒光素酶報告基因（Luciferase reporter gene）系列產(chǎn)品。該系列包括世界全面的不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒和慢病毒顆粒及相應的報告基因檢測試劑盒，包括單熒光素酶報告基因檢測試劑盒；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒；活體成像試劑等。
      


       
      

      


      

       
      


      

      

      

      

      

       
      

      


      細胞膜錨定海熒光素酶
      


      

       
      

      

      

      

      

      


      膜錨定受體或抗體，膜錨定受體或抗體，可以特異性地捕獲配體、抗原或半抗原，這些配體或半抗原可以通過放射性、磁性或熒光探針標記進行檢測。[2]例如，野生型的熒光素酶一般都是分泌到細胞區(qū)域，光信號都是從細胞培養(yǎng)基中獲得。膜錨定熒光素酶是表達于細胞膜上?？梢怨潭ㄓ^察基因表達信號的強弱。海熒光素酶（Cypridina luciferase，CLuc） 經(jīng)過改造可以錨定在細胞膜上，又被稱為細胞膜錨定的海熒光素（membrane-anchored Cypridina luciferase，maCLuc）酶圖4展示的是導入熒光素酶的C6 細胞(鼠膠質(zhì)瘤)被植入鼠大腿肩膀處。移植后7天進行成像。
      


       
      

      


      

      


      圖4.左圖為野生型熒光素酶，右圖為膜錨定熒光素酶。圖像是在給予CLuc特異性底物海熒光素后30 s進行成像
      

      


      

       
      


      綜上所述，多種報告基因和可選擇的標記基因廣泛用于診斷工具。更簡單，更快速和更靈敏的報告基因會繼續(xù)被開發(fā)應用于生命科學領(lǐng)域，翌圣生物作為生命科學領(lǐng)域工具提供者，將會陸續(xù)推出報告基因檢測系列產(chǎn)品，敬請期待。
      


       
      


       
      

      


      

      

      

      

      

       
      

      


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      參考文獻：
      


      [1] Atar Mohammed et al.Reporter Gene Application in Diagnostic Assay:ReviewInternational Journal of Genetics 5(2): 39-47, 2015
      


      [2] 劉荔楨,王燦,邵泓.報告基因法在生物技術(shù)藥物活性檢測中的應用[J].中國藥師,2021,24(07):349-352. DOI:10.19962/j.cnki.issn1008-049X.2021.07.029.
      


      [3] Soboleski, Mark R et al. “Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells.” FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology vol. 19,3 (2005): 440-2. doi:10.1096/fj.04-3180fje
      


      [4] Moroz, Maxim A et al. “Introducing a new reporter gene, membrane-anchored Cypridina luciferase, for multiplex bioluminescence imaging.” Molecular therapy oncolytics vol. 21 15-22. 17 Mar. 2021, doi:10.1016/j.omto.2021.03.004
      


      [5] 牛安娜;蘇昕;張曉鵬;;報告基因法在生物技術(shù)藥物活性檢測中的應用[J];生物技術(shù)通訊;2019年02期。
      

      

      


       
      


      


       
      

       
       
       
       
       
       
       
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