你是否正在驗證miRNA與lncRNA的作用機制？

是否在分析確認(rèn)miRNA的靶基因？

在研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的實驗中，你是否想確定結(jié)合位點的序列？

這些問題都可以用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)來嘗試解決。

 

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)介紹

 

 

 

 

基于熒光素酶（luciferase）的發(fā)光原理，科學(xué)家發(fā)明了雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可催化各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光，產(chǎn)生的熒光數(shù)值大小即表示了兩種酶的表達量多少。

圖1. Luciferase發(fā)光原理

Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報告基因，是因為在基因表達調(diào)控研究時，利用兩者表達產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調(diào)控作用（見圖2）。與此同時，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以便消除細胞轉(zhuǎn)染等因素帶來的組間誤差。

圖2. 報告基因系統(tǒng)用于基因表達調(diào)控研究

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)中的luciferase來源于細菌、螢火蟲、發(fā)光海洋生物等，可以在哺乳細胞中直接表達，無需表達后修飾，直接具備完全酶活性。與綠色熒光蛋白（GFP）不同，它們的發(fā)光檢測不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā)光穿透力更強，這使其具備可定量、高靈敏度及低背景等特點。

 

雙熒光素酶報告基因檢測的應(yīng)用

 

 

 

 

下面從實驗方案設(shè)計、實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析幾個方面介紹幾個案例，供大家參考。

1、利用雙報告基因檢測系統(tǒng)研究miRNA與3’UTR的相互作用

實驗?zāi)康模?/span>驗證大鼠miR-1與靶基因ATG13 3’UTR是否發(fā)生作用，并進一步確定miR-1與ATG13 3’UTR的作用位點。

實驗方案：構(gòu)建luc-3’-UTR-WT載體和luc-3’-UTR-mut載體，將其與海腎載體及miRNA mimics共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染24-48h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（翌圣產(chǎn)品貨號：11402ES）和Promega GloMax Multi Plus酶標(biāo)儀進行檢測。

實驗結(jié)果：

圖3. miR-1與3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）

實驗結(jié)論：從圖中可以看出，mimic-miR-1對ATG13 3’ -UTR-mut無明顯調(diào)控作用，而對3’-UTR有明顯抑制作用。綜上，ATG13 3’ -UTR-WT為miR-1靶序列。

 

2、利用雙報告基因檢測系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用

實驗?zāi)康模?/span>驗證轉(zhuǎn)錄因子IRF3對IFN-β啟動子的調(diào)控作用。

實驗方案：構(gòu)建Luc-IFN-β啟動子載體和IRF3的過表達載體。共轉(zhuǎn)染后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（翌圣產(chǎn)品貨號：11402ES）和SpectraMax  L酶標(biāo)儀進行檢測。

實驗分組：對照組為Luc-IFN-β和pTK-RL，實驗組為Luc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的過表達載體共轉(zhuǎn)染。

實驗結(jié)果：

圖4. IRF3對IFN-β啟動子的調(diào)控

實驗結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子IRF3對IFN-β啟動子起正調(diào)控作用。

 

 

影響雙熒光素酶報告基因檢測的因素

 

 

 

 

作為報告基因檢測試劑研發(fā)的廠家，我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)了獲取好數(shù)據(jù)的方法，避免大家掉坑：

坑1：檢測數(shù)值太低

正常表達水平下，熒光值的數(shù)量級應(yīng)在10⁴-10⁷數(shù)量級左右，導(dǎo)致數(shù)值低主要有以下幾個原因：啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因，具體的原因需要實驗者進行排查。相應(yīng)的解決方案如下表：

坑2：復(fù)孔差異大

雙報告基因檢測系統(tǒng)較為靈敏，檢測結(jié)果受多種因素的影響，因此，一般設(shè)置3個或3個以上的復(fù)孔，復(fù)孔之間有差異是正常的，差異在同一個數(shù)量級可以接受。想要得到更準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，需盡量減少復(fù)孔的差異性，建議如下：

1、裂解后建議離心取上清，保證樣本均一性；

2、保證加樣的準(zhǔn)確性；

3、樣品和底物混合后到檢測前的時間以及檢測時間應(yīng)控制在相同的時間內(nèi)。

以上的實驗方案和建議是否對您有幫助呢？如有不解歡迎致電小翌。祝大家實驗順利~
 

使用翌圣產(chǎn)品（貨號：11402）發(fā)表的相關(guān)文獻

[1]. Huang X, He M, Huang S, et al. Circular RNA circERBB2 promotes gallbladder cancer progression by regulating PA2G4-dependent rDNA transcription[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 166.

[2]. Yin Q, Wang J, Fu Q, et al. CircRUNX2 through has‐miR‐203 regulates RUNX2 to prevent osteoporosis[J]. Journal of cellular and molecular medicine, 2018, 22(12): 6112-6121.

[3]. Luo E, Wang D, Yan G, et al. The NF-κB/miR-425-5p/MCT4 axis: A novel insight into diabetes-induced endothelial dysfunction[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2019: 110641.

[4]. Wu Z, Huang W, Wang X, et al. Circular RNA CEP128 acts as a sponge of miR-145-5p in promoting the bladder cancer progression via regulating SOX11[J]. Molecular Medicine, 2018, 24(1): 40.

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產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
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	11402ES80	1000T
Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒	11401ES60	100T
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