1、DNA文庫(kù)構(gòu)建方法的選擇：為什么酶切法建庫(kù)如此備受青睞？

酶切法構(gòu)建DNA文庫(kù)，相較于傳統(tǒng)的超聲法和轉(zhuǎn)座酶法具有以下優(yōu)勢(shì)：

無(wú)偏好片段化酶：具有穩(wěn)定的片段化效果，無(wú)需復(fù)雜的機(jī)械片段化過(guò)程。酶切產(chǎn)物片段大小同樣本類(lèi)型、Input DNA量和GC含量等均無(wú)相關(guān)性，僅與酶切時(shí)間有關(guān)。

DNA損傷風(fēng)險(xiǎn)低：機(jī)械力會(huì)引起DNA的物理?yè)p傷，尤其是對(duì)于脆弱或較少量的樣本。酶切法使用的片段化酶是針對(duì)特定序列進(jìn)行切割的，這種生物化學(xué)反應(yīng)通常在較溫和的條件下進(jìn)行，能夠最大限度地減少對(duì)DNA的物理?yè)p傷。

建庫(kù)流程精簡(jiǎn)：一步完成片段化/末端修復(fù)/加A ，片段化/末端修復(fù)/加A （30min）-接頭連接（15min）-純化/分選（30min）-文庫(kù)擴(kuò)增（15min）-純化分選（30min），常規(guī)建庫(kù)預(yù)計(jì)耗時(shí)約2h，PCR-free建庫(kù)預(yù)計(jì)耗時(shí)1h。

寬泛的樣本投入范圍：相比較固定投入量，固定酶切時(shí)間的TN5建庫(kù)，酶切法建庫(kù)適用500 pg-1 μg，滿足個(gè)性化建庫(kù)。

翌圣Onepot系列酶切法建庫(kù)流程

2、酶切法建庫(kù)運(yùn)用的是什么酶，類(lèi)似限制性酶切酶嗎，具體如何打斷DNA呢？

不同于限制性酶切酶，片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶，不受特定酶切位點(diǎn)的限制，隨機(jī)切割對(duì)應(yīng)模板DNA，片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端，后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。

3、酶切法建庫(kù)適合哪些應(yīng)用研究，對(duì)樣本具有普適性嗎？

酶切法建庫(kù)可適用全基因組測(cè)序（含PCR-free文庫(kù)構(gòu)建）、全基因組重測(cè)序、全外顯子或其他靶向捕獲測(cè)序、宏基因組測(cè)序等。適合樣本類(lèi)型包含gDNA、cDNA和FFPE樣本等，不適合cfDNA（cfDNA無(wú)需打斷）。

4、酶切法建庫(kù)試劑盒針對(duì)哪些樣本建庫(kù)效果比較好？

兼容范圍為1 ng – 1μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。基因組DNA和cDNA均可獲得高產(chǎn)高質(zhì)的文庫(kù)。

舉例：展示為翌圣onepot pro系列12972ES應(yīng)用于不同物種的文庫(kù)均一性測(cè)試

結(jié)論：以200 ng不同物種gDNA為模板，使用12972ES和廠商A建庫(kù)試劑進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，膠圖顯示，12972ES在文庫(kù)均一性上表現(xiàn)優(yōu)于廠商A。

5、對(duì)于不同類(lèi)型的DNA樣本，酶切時(shí)間如何控制？

對(duì)于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時(shí)間如下：

為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，建議在自身實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)。

6、gDNA片段化參考說(shuō)明書(shū)酶切條件酶切20 min，竟然切不動(dòng)？

一般優(yōu)先考慮DNA的質(zhì)量問(wèn)題，比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子，可能會(huì)影響酶切效果，建議將DNA稀釋在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進(jìn)行片段化。其次，如果樣本是反轉(zhuǎn)錄得到的全長(zhǎng)cDNA，則需考慮樣本純度問(wèn)題。另外，對(duì)于環(huán)狀DNA的酶切，需要另行摸索酶切時(shí)間體系。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進(jìn)行酶切或適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間。

7、FFPE樣本，酶切時(shí)間太難控制了？

眾所周知，F(xiàn)FPE樣本雖然使組織得以長(zhǎng)期保存，但其特殊的制作方法和保存過(guò)程對(duì)核酸分子造成多方面的影響：核酸與蛋白交聯(lián)、降解嚴(yán)重等諸多問(wèn)題。我們先來(lái)看下不同質(zhì)量的FFPE樣本，采用相同的酶切條件影響有多大。

舉例：相同酶切條件下，質(zhì)量高的樣本酶切效果較好，滿足需求（樣本4），質(zhì)量差的樣本出現(xiàn)過(guò)度酶切現(xiàn)象，酶切片段偏?。颖?/3）。

因此對(duì)于不同降解程度的FFPE樣本，建議做好質(zhì)量控制，對(duì)樣本進(jìn)行分層級(jí)，不同層級(jí)的推薦酶切時(shí)間參考下表。

備注：FFPE樣本DNA質(zhì)量也可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡(jiǎn)單判斷，高質(zhì)量樣本-DNA質(zhì)量大于10kb，條帶明亮單一，建議酶切10 min左右；一般質(zhì)量樣本-膠圖顯示無(wú)明顯主帶，整體彌散條帶，建議酶切6-8 min；質(zhì)量較差樣本-膠圖無(wú)主帶，整體條帶弱，建議酶切2 min；極差FFPE樣本，建議可不酶切，搭配FFPE修復(fù)試劑直接建庫(kù)。

8、DNA酶切后文庫(kù)出現(xiàn)大片段殘留？

酶切文庫(kù)出現(xiàn)大片段殘留現(xiàn)象，考慮Input DNA純度外，建議適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間或提高酶切溫度。另外，也需要選擇合適的循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)過(guò)高會(huì)導(dǎo)致過(guò)度擴(kuò)增，過(guò)度擴(kuò)增文庫(kù)會(huì)出現(xiàn)大片段殘留。

9、酶切時(shí)間也不長(zhǎng)，竟然過(guò)度酶切了?

以插入片段300 bp為例，白細(xì)胞gDNA，30 ℃酶切20 min，出現(xiàn)如下圖過(guò)度酶切現(xiàn)象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小，如白細(xì)胞gDNA較小，應(yīng)適當(dāng)縮短酶切時(shí)間，否則易出現(xiàn)如下過(guò)度酶切現(xiàn)象。

10、酶切法建庫(kù)，如何做到較好的質(zhì)量控制？

1）文庫(kù)濃度檢測(cè)：qubit法或qPCR

2）文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳、Agilent 2100/2200或Qseq

3）文庫(kù)質(zhì)量鑒定：Agilent 2100/2200或Qseq

4）文庫(kù)大小分布、引物二聚體和過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失，可通過(guò)電泳方法進(jìn)行確認(rèn)

構(gòu)建優(yōu)質(zhì)的DNA文庫(kù)不僅需關(guān)注上述因素，還需選擇高質(zhì)量的建庫(kù)產(chǎn)品。翌圣生物為滿足廣大科研工作者的NGS建庫(kù)實(shí)驗(yàn)需求，推出了全面的NGS建庫(kù)解決方案，方便大家根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。