手把手教你做出RT-qPCR最美曲線(四)：如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物？
通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線(三)：逆轉(zhuǎn)錄酶，你真的了解嗎？》一文的學(xué)習(xí)，相信大家對逆轉(zhuǎn)錄酶有了一定的了解，但選對了逆轉(zhuǎn)錄酶并不意味著你的逆轉(zhuǎn)錄實驗就大功告成，逆轉(zhuǎn)錄引物的正確選擇也是重要一環(huán)。根據(jù)不同實驗?zāi)康模孓D(zhuǎn)錄引物的選擇也是大相徑庭。接下來，小翌與大家一同學(xué)習(xí)下逆轉(zhuǎn)錄引物的相關(guān)知識，學(xué)會如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物。
PART 01
逆轉(zhuǎn)錄引物介紹
1
Oligo（dT）
2
隨機引物
3
基因特異性引物
PART 02
逆轉(zhuǎn)錄引物優(yōu)劣勢比較
|
引物類型 |
結(jié)合部位 |
優(yōu)點 |
缺點 |
|
Oligo(dT) |
真核生物mRNA3’端poly(A)尾 |
可合成全長cDNA |
1、僅擴增有polyA尾的mRNA 2、對模板質(zhì)量要求高 |
|
隨機引物 |
RNA的許多隨機可結(jié)合部位 |
適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板 |
特異性低，小片段多 |
|
基因特異性引物 |
特異性互補序列 |
特異性強，靈敏度高 |
僅合成特定的序列 |
PART 03
逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇
RNA類型：
1、真核生物mRNA
2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板
原因：
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合
2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合
RNA類型：
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板
2、長度比較長、有二級結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板
隨機引物可以在任意位點和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)
RNA類型：
1、已知基因序列的模板
2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板
原因：
1、針對特定序列設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物
2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物
【注】:為提高反轉(zhuǎn)錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，建議將Oligo(dT)和隨機引物混合使用。
PART 04
精品推薦
|
RNA類型 |
引物選擇 |
原因 |
|
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板 |
Oligo(dT) |
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合 |
|
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板 2、長度比較長、有二級結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板 |
隨機引物 |
隨機引物可以在任意位點和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)。 |
|
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板 |
基因特異性引物 |
1、針對特定序列設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物 2、miRNA（莖環(huán)法）的反轉(zhuǎn)錄，需要根據(jù)基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物 |
PART 05
Hifair® Ⅲ 系列逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示
可耐受60℃反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄
圖1. 以500 ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair® Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat NO.11139ES) 在42℃-65℃下進行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)擴增TFRC基因（4.4kb）。M:1 kb DNA ladder.
圖2. 以500 ng 293T細胞的總RNA為模板，oligo dT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.9 kb）5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
線性檢測范圍廣，Total RNA 10 pg-5 μg
圖3. 以10 pg-5 μg的293T細胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴增PTTG1基因。
PART 06
相關(guān)產(chǎn)品
|
產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
|
單酶 |
11110ES92/93 |
|
|
高靈敏度單酶 |
11111ES92/93 |
|
|
Kit |
11119ES60 |
|
|
Kit(含gDNA去除步驟) |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
|
高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
|
預(yù)混液 |
11120ES60 |
|
|
預(yù)混液（含gDNA去除步驟） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11123ES60 |
|
高靈敏預(yù)混液（含gDNA去除步驟） |
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
PART 07
翌圣逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品已發(fā)表文獻（部分）
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)
以上是小翌本期給大家分享的內(nèi)容，主要介紹了逆轉(zhuǎn)錄引物的種類、優(yōu)缺點和選擇應(yīng)用。下期，我們將給大家分享逆轉(zhuǎn)錄實驗中的一些注意事項，我們下期不見不散哦~
最后就是小翌發(fā)福利的時候啦，掃描以下二維碼填寫表單，即可免費申請逆轉(zhuǎn)錄系列產(chǎn)品試用裝哦~
