手把手教你做出RT-qPCR最美曲線(三)：逆轉(zhuǎn)錄酶，你真的了解嗎？
通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線(二)：如何評估RNA質(zhì)量？》一文的學(xué)習(xí)。相信大家已經(jīng)獲得了優(yōu)質(zhì)的RNA，即將進入逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)。
對于逆轉(zhuǎn)錄，大家都知道它是以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補DNA (complementary DNA，cDNA)的過程（如圖1）。但對于過程中起關(guān)鍵作用的逆轉(zhuǎn)錄酶，可能比較陌生。接下來，讓小翌給大家介紹下逆轉(zhuǎn)錄酶的相關(guān)理論知識。
圖1. 逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖
圖2. 中心法則示意圖
逆轉(zhuǎn)錄酶屬于DNA聚合酶的一類，可以聚合dNTP合成cDNA鏈，這一過程的發(fā)生，依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶的2大活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。
表1. M-MLV和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的特征比較
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M-MLV |
AMV |
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來源 |
莫洛尼鼠白血病病毒 |
禽成髓細胞瘤病毒 |
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熱穩(wěn)定性 |
差，37-42℃ |
好，42-55℃ |
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最適pH |
7.6 |
8.3 |
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RNase H活性 |
弱 |
強 |
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cDNA合成得率 |
較高 |
低 |
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合成長度 |
長，可達2-3kb |
短 |
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對抗復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的能力 |
弱 |
強 |
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優(yōu)勢 |
合成產(chǎn)物長度長、含量高 |
比M-MLV更耐熱，適合具有一定復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄 |
雖然野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性差，抵抗復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA能力弱，但通過對其進行改造可彌補這些不足。漸漸地，改造后的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶成為了市場的主流產(chǎn)品。
為了提高M-MLV的逆轉(zhuǎn)錄能力，翌圣生物在野生型M-MLV的基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)開發(fā)出了Hifair®系列逆轉(zhuǎn)錄酶，包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆轉(zhuǎn)錄酶。
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產(chǎn)品形式 |
產(chǎn)品名稱和編號 |
引物 |
適用實驗類型 |
產(chǎn)品特點 |
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單酶 |
Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES |
無 |
PCR/qPCR |
A.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30min 總RNA使用范圍：1ng-5μg 合成cDNA長度：10kb |
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B.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15min 總RNA使用范圍：10pg-5μg 合成cDNA長度：19.8kb |
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酶和buffer 分開 |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)/11121ES |
單獨成管的oligodT、random primer |
PCR/qPCR
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同A |
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同B |
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酶和buffer預(yù)混 |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)/11123ES |
按比例預(yù)混的oligodT、random primer |
qPCR |
C.逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃,30min 總RNA使用范圍:1ng-5μg 2×預(yù)混液 |
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Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES |
D.逆轉(zhuǎn)錄條件：55℃,15min 總RNA使用范圍：10pg-5μg 4×預(yù)混液，可投入更大體積模板 |
◎ 可耐受60℃反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄
圖3. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat NO.11139ES)在42℃-65℃下進行逆轉(zhuǎn)錄。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)擴增TFRC基因（4.4kb）。M:1kb DNA ladder.
◎ 優(yōu)越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
圖4. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
◎ 出色的逆轉(zhuǎn)錄效率，適合不同 GC 含量、不同表達豐度的基因
圖5. 以300ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat NO.11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA為模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴增20個不同GC含量（25-65%）、不同表達豐度的基因。
◎ 線性檢測范圍廣，Total RNA 10pg-5μg
圖6.以10pg-5μg的293T細胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴增PTTG1基因。
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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單酶 |
11110ES92/93 |
1/5×10KU |
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高靈敏度單酶 |
11111ES92/93 |
1/5×10KU |
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Kit |
11119ES60 |
100T |
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Kit(含gDNA去除步驟) |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
100T |
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高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11139ES60 |
100T |
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預(yù)混液 |
11120ES60 |
100T |
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預(yù)混液（含gDNA去除步驟） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) |
11123ES60 |
100T |
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高靈敏預(yù)混液（含gDNA去除步驟） |
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
11141ES60 |
100T |
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[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2]. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
[3]. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4]. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5]. Xu L , Xu S , Sun L , et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1).(IF 11.607)
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