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      干貨|你對DNase I“全能選手”了解多少？
       
      

      脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I），是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA的非特異性核酸內(nèi)切酶。它能夠水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有5'-磷酸基團和3'-OH基團的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。DNase I最佳的工作pH范圍是7-8，其活性依賴于Ca2+，并可被二價金屬離子如Mn2+，Mg2+，Zn2+等激活。在Mg2+存在條件下，DNase I 隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；Mn2+存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。
      


       
      

      


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      圖1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖
      


       
      


      常見的DNase I主要從牛胰腺中純化或為重組酶。與從牛胰腺中純化的DNase I相比，重組酶來源的內(nèi)源性RNase水平相對較低或者能夠制備成無RNase產(chǎn)品形式，更適合對RNase敏感的應用，如從RNA樣品中去除DNA。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      

      DNase I 的應用
      

      

      

      

      

      

      


      

       
      


      提到應用，DNase I除了大家熟知的用于維護RNA完整性相關實驗，如提取不含DNA的RNA，反轉(zhuǎn)錄前制備無gDNA的RNA模板以及體外轉(zhuǎn)錄后降解DNA模板外，還可用于rRNA去除中消化DNA探針，缺口平移進行DNA標記，足跡法分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用，生成隨機的DNA文庫，減少細胞裂解物或蛋白提取物的粘性，在細胞培養(yǎng)過程中作為添加物來消化細胞間的粘連，在細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照等。綜上所述，DNase I幾乎可用于任何需要酶切DNA的應用中。下面小編簡單介紹幾種常見的應用。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除gDNA
      

      

      

      

      


      

       
      


      

      RNA作為實驗室常研究的樣本，其質(zhì)量的高低很大程度上會直接影響實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量。一般在RNA提取過程中無法完全避免gDNA殘留，因此，在進行具有挑戰(zhàn)性的下游應用（例如mRNA表達量分析，轉(zhuǎn)錄組分析等）之前，通常建議對RNA樣本進行DNase I處理，消化殘留的gDNA。消化gDNA步驟可以在RNA提取期間、RNA提取后或者RNA反轉(zhuǎn)錄之前進行。
      

      


      

      


      圖2：基于DNase I的gDNA去除流程
      


       
      

      

      


      

      

      

      

      

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      體外轉(zhuǎn)錄去除模板DNA
      

      

      

      

      


      

       
      


      

      體外轉(zhuǎn)錄（IVT）主要是以DNA為模板，在適當?shù)牡孜锖途彌_液的作用下，通過體外轉(zhuǎn)錄得到RNA。這一過程中，常用的RNA聚合酶包括T7，T3，SP6等，它們負責催化RNA的合成。然而，合成的RNA產(chǎn)品可能會含有DNA殘留，消除DNA殘留有利于下游實驗的開展。
      


      特別是在mRNA疫苗的研發(fā)過程中，去除這些DNA殘留是一個非常關鍵的步驟，它直接關系到后續(xù)純化過程的難易程度及最終產(chǎn)品的純度。為了高效地消除模板DNA，通常采用DNase I進行處理，以確保RNA樣品中不含有DNA殘留，這一步驟有助于提高實驗的整體準確性和效率。
      

      

      


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      圖3：線性化質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄過程
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      rRNA去除：常應用于RNA建庫測序
      

      

      

      

      


      

       
      


      在生物體內(nèi)，rRNA豐度高且非常保守，其對于獲取生物信息研究意義不大。然而，實驗過程中提取到的總RNA中有95%是人源rRNA，這些rRNA的存在可能會干擾靶標RNA的檢測。因此，在RNA建庫測序中，通常會先將rRNA去除。目前，rRNA的去除方式以RNA酶消法為主，其主要操作步驟與原理如下：
      


       
      


      

      

      

      

      

      

      

      操作步驟
      

      

      

      

      


      

       
      

      


      

      1.提取Total RNA；
      


       
      


      2.單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結合（注：需要設計與合成rRNA 特異性單鏈 DNA 探針）；
      


       
      


      3.RNase H降解雜交的rRNA；
      


       
      


      4.DNase I降解DNA 探針；
      


       
      


      5.rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。
      

      

      

      

      


       
      

      


      

       
      
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      圖4：基于酶法的rRNA去除原理示意圖
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      缺口平移法進行DNA標記
      

      

      

      

      


      

       
      


      缺口平移法，是實驗室最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。該方法是DNase I與E.coli DNA Polymerase I的聯(lián)合作用實現(xiàn)的。
      


       
      


      

      

      

      

      

      

      

      主要原理如下：
      

      

      

      

      


      

       
      

      


      

      1.先用適宜濃度的DNase I在待標記的雙鏈DNA的每一條鏈上產(chǎn)生若干個單鏈缺口，缺口處形成3’羥基末端。
      



      
2.再用E.coli DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性從缺口處5’端切除一個核苷酸，同時E.coli DNA Polymerase I的5’→3’聚合酶活性將一個帶標記的核苷酸引入到缺口的3'端，以修補缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動，標記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。
      

      

      

      

      


       
      

      


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      圖5：缺口平移法進行DNA標記的原理示意圖
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      DNase I 足跡法分析實驗
      

      

      

      

      


      

       
      


      DNase I足跡法分析實驗是一種精確鑒定DNA結合蛋白在DNA分子上的結合位點的檢測方法。其原理是蛋白結合在DNA片段上，能保護結合部位不被DNase I破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段（即“足跡”)，進而可以確定其序列。在凝膠圖片中，相應與蛋白結合的部位沒有條帶。
      


       
      


      

      

      

      

      

      

      

      實驗大致步驟如下：
      

      

      

      

      


      

       
      

      


      

      1.將待檢雙鏈DNA分子進行單鏈末端標記。
      



      
2.將蛋白質(zhì)和DNA混合后，加入適量的DNase I進行酶切，形成不同長度的DNA片段。該過程需要控制酶的用量，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個核苷酸，并列設置未加蛋白質(zhì)的對照。
      



      
3.從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA用PAGE電泳分離，放射自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。
      

      

      

      

      


       
      


      常見應用：轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白通過與啟動子區(qū)域結合來調(diào)控靶標基因的轉(zhuǎn)錄。
      


       
      


      相關實驗：凝膠阻滯實驗（EMSA）。EMSA可以確定蛋白是否與DNA直接結合，而DNase I足跡法分析實驗則可以精確鑒定其結合的DNA序列。
      


       
      


       
      

      


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      圖6：DNase I足跡法分析實驗原理圖【1】
      


       
      


       
      


      

      

      

      

      

      

      

      翌圣DNase I 選擇指南
      

      

      

      

      

      

      

      


       
      


      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品定位
      
			      		
			
			
      推薦應用
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas 脫氧核糖核酸酶I，來源于牛胰腺（CAT#10607，10608）
      
			      		
			
			
      未對RNase進行檢測
      
			      		
			
			
      主要應用于蛋白質(zhì)研究: 從蛋白制備物中去除 DNA。
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      Recombinant DNase I (RNase-free)（CAT#10325）
      
			      		
			
			
      無RNase殘留，研究級別
      
			      		
			
			
      適用于各種應用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實驗樣品制備。
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      UCF.ME® Deoxyribonuclease I  (DNase I) GMP-grade（CAT#10611）
      
			      		
			
			
      無RNase殘留，GMP藥用級別。采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
      
			      		
			
			
      適用于各種應用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實驗樣品制備。
      
			      		
		
      
	      

      


       
      


       
      


      

      

      

      

      

      

      

      參考文獻
      

      

      

      

      

      

      

      


      

        
	
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      2. Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparison of oncogenic HPV type‐specific viral DNA load and E6/E7 mRNA detection in cervical samples: results from a multicenter study[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.
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      3. Huang Z, Fasco M J, Kaminsky L S. Optimization of Dnase I removal of contaminating DNA from RNA for use in quantitative RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.
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      400-6111-883