DNA聚合酶是PCR反應中不可或缺的組成部分，是參與DNA復制中的重要酶，被用在生物及醫(yī)學等領(lǐng)域的各個研究方向上。PCR技術(shù)發(fā)明至今40多年的時間里，從早期被發(fā)現(xiàn)的Taq DNA聚合酶到現(xiàn)在，酶越來越多樣化。隨著新酶的發(fā)現(xiàn)和對舊酶的改造，DNA聚合酶的保真性、特異性、靈敏度等都獲得了明顯的改進。而高保真DNA聚合酶的出現(xiàn)正是順應了市場需求，下面小編將圍繞高保真DNA聚合酶的作用原理和應用方向等進行介紹。
 

 

圖1. PCR擴增的整個檢測過程^[1]

什么是高保真酶
 

高保真DNA聚合酶有聚合中心和酶切中心，聚合中心具有5'→3'的DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA；酶切中心具有3'→5'外切酶活性，可以進行堿基錯配的修復。常見的高保真DNA聚合酶類型有Pfu、KOD等。

 

圖2. DNA聚合酶的作用原理^[2]

如何選擇高保真酶
 

對于測序、基因功能研究、蛋白表達、定點突變等，高保真性的擴增是非常重要的，可以確保各種擴增子的可靠擴增。以測序文庫擴增過程為例，測序過程中的突變會給序列拼接造成困難，甚至會干擾某些需要低頻檢測的分析結(jié)果。對于市場上琳瑯滿目的各種高保真DNA聚合酶，選擇一款合適的酶產(chǎn)品是極為必要的。市面上常見的高保真酶特性主要包含保真度、擴增速率、特異性、是否耐U等。
 

保真度：錯配率是計算高保真DNA聚合酶保真性的一個通用標準，錯配率越低代表其保真性越好，保真度常用錯配率的倒數(shù)表示（保真度=1/錯配率），不同的測定方法也會產(chǎn)生不同的結(jié)果。常見的測定方法有以下三種：
 

檢測方法	檢測原理	優(yōu)缺點
藍白斑篩選測定	利用DNA聚合酶擴增lacZ基因，它可以還原β-半乳糖苷酶基因活性并產(chǎn)生藍色菌落，結(jié)合藍白斑篩選的結(jié)果可以評估保真度。	快速、相對簡單、經(jīng)濟有效；但是精確度不高，無法區(qū)分DNA的同義突變。
一代測序	將PCR擴增產(chǎn)物克隆至相應的載體中，通過對轉(zhuǎn)化后的單菌落進行Sanger測序，對測序結(jié)果中錯配的核苷酸數(shù)進行分析其保真度。	精確度高，可以檢測到所有的突變，但是工作量和成本都比較高。
NGS測序	使用NGS平臺，將PCR擴增后的經(jīng)相應處理后的文庫產(chǎn)物進行測序分析，從而計算DNA聚合酶擴增過程中的保真度。	精確度高，可以檢測到DNA突變。但是測序平臺本身有一定的錯誤率，且讀長受限較大。

       翌圣有多款表現(xiàn)穩(wěn)定的高保真DNA聚合酶。其中，Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，簡稱Canace plus） 具有一流的保真度，其保真性是Taq酶的83倍，Pfu酶的9倍。

 

圖3. Canace plus的保真度
 

擴增速率：合成能力是評估高保真DNA聚合酶非常重要的因素。原始的高保真DNA聚合酶因為具有較強的3'→5'外切酶活性，其合成能力較低。例如Pfu DNA聚合酶的合成速率還不到Taq DNA聚合酶的一半，但是翌圣Canace系列高保真酶，通過基因改造，聚合能力明顯提升，Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，簡稱Canace plus）擴增速率可至10 sec/kb。
 

 

圖4. Canace plus的擴增速率低至10 sec/kb。Canace plus分別擴增水稻gDNA 2 kb片段和小鼠gDNA 4 kb，模板投入量50 ng，35個循環(huán)，M：1 kb DNA Marker。
 

特異性：PCR擴增由低溫上升至高溫的過程中，酶的弱活性極易造成錯配或形成引物二聚體，這種非特異性擴增會顯著降低產(chǎn)物質(zhì)量。為了減少這種現(xiàn)象的發(fā)生，可以人為的在開始延伸之前不讓酶發(fā)揮活性，以保證擴增的特異性，這種方式也被形容為酶的熱啟動。Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10153)具備熱啟動特性，具有特異性高、靈敏性高、產(chǎn)量高的特點。
 

 

圖5. Canace plus擴增性能好。分別采用Canace plus(A)和市售高保真酶（競品1-B、競品2 -C）擴增小鼠gDNA 4 kb，M：1 kb DNA Marker。
 

是否耐U：Pfu校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，需要經(jīng)過特殊改造后方可耐受尿嘧啶，然后才能應用甲基化文庫構(gòu)建或者定點突變等。Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase(Cat#10145)是翌圣針對含尿嘧啶模板設(shè)計的高保真DNA聚合酶，根據(jù)其甲基化文庫產(chǎn)量，可以看出其擴增性能非常好。
 

樣本種類	甲基化文庫構(gòu)建
耐U高保真聚合酶(加入相同單位)	Yeasen	K*
Input DNA (ng)	4.5
擴增循環(huán)數(shù) (cycles)	7
平均產(chǎn)量(ng)	26.3	17.9

翌圣高保真DNA聚合酶選擇指南

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	貨號	主要應用
超高保真	Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase	10153ES	分子克隆
擴增含U模板	Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase	10145ES	甲基化模板擴增
高效率高保真	Hieff Canace® Pro High-Fidelity DNA Polymerase	13476ES	高通量測序

Q&A
 

1. Q：高保真DNA聚合酶擴增產(chǎn)物為平末端，TA克隆（或二代測序文庫構(gòu)建）如何在產(chǎn)物末端加A？

A：Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性可以在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個核苷酸“A”，反應體系和實驗條件可參照相應產(chǎn)品說明書。
 

2. Q：不同的高保真DNA聚合酶產(chǎn)品保真度有可比性嗎？

A：不同公司測定保真度的方法不同，產(chǎn)生的結(jié)果也不一樣，酶的保真度必須采用同種方法下才能夠相互比較。

看到這里，您現(xiàn)在對高保真酶的信息都了解了嗎？如果有其他疑問，可以聯(lián)系我們或者咨詢相應負責地區(qū)技術(shù)人員。
 

參考文獻

 

1. Hu M, Jex A R, Campbell B E, et al. Long PCR amplification of the entire mitochondrial genome from individual helminths for direct sequencing.[J]. Nature Protocols, 2007, 2(10):2339-2344.

2. Loeb L A, Jr R. DNA polymerases and human disease[J]. Nature Reviews Genetics.

3. Steitz, T. A. DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(25):17395-8.

4. Minor variant detection in amplicons using 454 massive parallel pyrosequencing: experiences and considerations for successful applications.[J]. BioTechniques, 2011.

5. Lundberg K S, Dan D S, Adams M, et al. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus.[J]. Gene, 1991, 108(1):1.