基因定點(diǎn)突變是目前生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案。對(duì)已知DNA片段的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系。

定點(diǎn)突變的應(yīng)用領(lǐng)域

 

蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)研究；

酶的活性或者動(dòng)力學(xué)特性改造；

啟動(dòng)子或者DNA作用元件改造；

蛋白的抗原性或穩(wěn)定性提升；

藥物研發(fā)&基因治療；

 

目前基因突變主要使用PCR介導(dǎo)的突變引入技術(shù)，常見(jiàn)的基因定點(diǎn)突變方法有重疊延伸PCR 法和滾輪擴(kuò)增法，各方法有利有弊。

 

 

圖1. 基于重疊延伸PCR的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

 

常規(guī)重疊延伸PCR需設(shè)計(jì)一對(duì)涵蓋突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行兩輪PCR，第一輪PCR由正向外側(cè)引物與突變引物合成片段1，由另一突變引物與反向外側(cè)引物合成片段2；第二輪PCR利用兩個(gè)片段作為模板擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)基因。該方法最大的缺陷是操作相對(duì)繁瑣，兩輪PCR擴(kuò)增和頻繁的DNA回收操作會(huì)提高原始質(zhì)粒污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且第二輪PCR受影響因素較多，有時(shí)反復(fù)調(diào)整PCR反應(yīng)條件也不能獲得目標(biāo)基因。

 

 

圖2. 基于滾輪擴(kuò)增原理的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

 

基于滾輪擴(kuò)增原理的定點(diǎn)突變方法需設(shè)計(jì)一對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用DNA聚合酶擴(kuò)增，獲取的擴(kuò)增片段完成5‘端磷酸化后在DNA連接酶的作用下環(huán)化，原始質(zhì)粒在DpnI的酶切作用下被消化，最終獲得突變質(zhì)粒，該方法的缺陷在于7-10 Kb全長(zhǎng)質(zhì)粒的擴(kuò)增往往不順利，若不徹底消化原始質(zhì)粒也容易產(chǎn)生假陽(yáng)性克隆。同時(shí)，若需要完成多位點(diǎn)的定向突變，則需要花費(fèi)更多的時(shí)間精力以及試劑成本。

 

 

圖3. 基于同源重組技術(shù)的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

 

目前市面上還存在著一種基于同源重組技術(shù)的定點(diǎn)突變方法，該方法需要在反向PCR引物中引入同源臂和突變位點(diǎn)，獲取的產(chǎn)物在剔除掉原始模板后，于重組酶的作用下發(fā)生同源重組形成全長(zhǎng)目的基因。該方法應(yīng)用范圍廣，可進(jìn)行單點(diǎn)、多點(diǎn)突變以及插入缺失等等，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度更長(zhǎng)，可滿足十幾Kb全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增需求，所要花費(fèi)的時(shí)間精力等成本更少。
 

三種定點(diǎn)突變方法比對(duì)

	基于重疊延伸PCR法定點(diǎn)突變	基于滾輪擴(kuò)增原理的定點(diǎn)突變	基于同源重組技術(shù)的定點(diǎn)突變
難度系數(shù)	★★★★★	★★★	★★★
所需時(shí)間	★★★★★	★★★	★★★
基因長(zhǎng)度	★★	★★★	★★★★★
突變效率	★★	★★★	★★★★★
適用范圍	單點(diǎn)突變、多點(diǎn)突變	單點(diǎn)突變，多點(diǎn)突變需花費(fèi)大量時(shí)間	單點(diǎn)突變、多點(diǎn)突變

 

 

翌圣生物匠心研發(fā)的定點(diǎn)突變?cè)噭┖谢?/span>Hieff Clone® 快速克隆技術(shù)的定點(diǎn)突變系統(tǒng)，目標(biāo)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化、Hieff Clone®重組環(huán)化后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可完成定點(diǎn)突變。高效快速的實(shí)現(xiàn)直接對(duì)目標(biāo)質(zhì)粒中的靶位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)突變，多點(diǎn)突變，以及插入或缺失等。

 

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

應(yīng)用范圍廣：可進(jìn)行單點(diǎn)，多點(diǎn)突變

擴(kuò)增性能優(yōu)越：超高保真酶可擴(kuò)增長(zhǎng)度小于20 Kb的任何質(zhì)粒

高效DpnI酶：可充分有效降解未突變的質(zhì)粒模板

 

產(chǎn)品列表

應(yīng)用	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	規(guī)格
單堿基、不連續(xù)雙堿基	Hieff  Mut Site-Directed Mutagenesis Kit 定點(diǎn)突變?cè)噭┖?/span>	11003ES10	10 T
三至五個(gè)不連續(xù)位點(diǎn) （相距超過(guò)50 bp）	Hieff  Mut Site-Directed Mutagenesis Kit 多點(diǎn)突變?cè)噭┖?/a>	11004ES10	10 T