活體成像試劑D-Luciferin熒光素酶-生物化學(xué)發(fā)光檢測法
背 景
活體成像技術(shù)（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學(xué)發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內(nèi)，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng)，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測光強度，間接反映出細胞數(shù)量的變化或細胞的定位。這項技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，常用的有腫瘤或疾病動物模型的建立，并可用于病毒學(xué)研究、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等。
原 理
常見的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，編碼基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長不同），當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性。
D-Luciferin（D熒光素）
D-Luciferin：有三種，分別是D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽、D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽和D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素YEASEN公司提供幾種常用類型的D-Luciferin，每批試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量驗證（經(jīng)9次獨立的HPLC和FTIR標準法監(jiān)測）和發(fā)光效率檢測，確?？蛻裘看卧囼灥母咧貜?fù)性和成功性。所有產(chǎn)品都可用于體內(nèi)成像分析和體外化學(xué)發(fā)光檢測實驗。YEASEN的D-Luciferin是合成的螢火蟲熒光素，結(jié)構(gòu)與promega公司提供的甲蟲熒光素一致，是水溶性的螢火蟲熒光素酶底物。
（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽
分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 純度：高級純（99.7%）
應(yīng) 用：
1）體外化學(xué)發(fā)光分析（in vitro）；
2）活體成像實驗（in vivo）；
3）高靈敏度ATP分析；
步 驟：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）用33.3 mL蒸餾水溶解1.0 gD-熒光素鈉鹽，配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。
4）待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活體成像分析
1）用無菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取決于注射方式，具體如下：
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注射方式 |
劑量 |
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靜脈注射（25-27 gauge針頭） |
按10 uL/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15 mg/mL熒光素工作液 |
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腹腔注射（25-27 gauge針頭） |
按10 uL/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15 mg/mL熒光素工作液 |
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肌肉注射（27 gauge針頭） |
50 uL，濃度為1–2 mg/mL熒光素工作液 |
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鼻內(nèi)注射（pipette） |
50 uL，濃度為3 mg/mL熒光素工作液 |
3）注射入體內(nèi)5-10分鐘后，進行成像分析。
（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽
分子式：KC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 純度：高級純（99.7%）
應(yīng)用：
1）活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析；
2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。
2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配制工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基直至無殘留。
4）圖像分析前立即向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析（或者細胞放在37℃短時間孵育后檢測可增強信號）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活體成像分析
1）用無菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g體重的濃度向每支小鼠注射相應(yīng)量的15mg/mL熒光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后進行成像分析。（對每只動物模型做熒光素動力學(xué)研究以確定峰值信號獲取時間）
（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素
分子式：C11H8N2O3S2 分子量：280.330 g/mol 外觀：白色至淺黃色粉末
溶解：0.25%濃度溶解于甲醇，形成近乎無色至淺黃色的清夜
保存：-15°C 避光
應(yīng)用：
1）活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析；
2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；
應(yīng)用實例：
活體成像檢測CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T細胞對小鼠皮下注射HN4細胞成瘤的治療作用（Mei Z et al. Cancer Med. 2020 ）
使用熒光素（Luciferin）發(fā)表的文獻:
[1] Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.
[2] Tang Y, Lin S, Yin S, Jiang F, Zhou M, Yang G, Sun N, Zhang W, Jiang X. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020 Feb;232:119727. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119727. Epub 2019 Dec 24. PMID: 31918223.
[3] Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.
[4] Zhou Y , Zhou C , Zou Y , Jin Y , Han S , Liu Q , Hu X , Wang L , Ma Y , Liu Y . Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis. Biomater Sci. 2020 Sep 21;8(18):5029-5046. doi: 10.1039/d0bm00840k. Epub 2020 Aug 19. PMID: 32812957.
[5] Ni XR, Zhao YY, Cai HP, Yu ZH, Wang J, Chen FR, Yu YJ, Feng GK, Chen ZP. Transferrin receptor 1 targeted optical imaging for identifying glioma margin in mouse models. J Neurooncol. 2020 Jun;148(2):245-258. doi: 10.1007/s11060-020-03527-3. Epub 2020 May 13. PMID: 32405996.
[6] Wu D, Lv J, Zhao R, Wu Z, Zheng D, Shi J, Lin S, Wang S, Wu Q, Long Y, Li P, Yao Y. PSCA is a target of chimeric antigen receptor T cells in gastric cancer. Biomark Res. 2020 Jan 28;8:3. doi: 10.1186/s40364-020-0183-x. PMID: 32010446; PMCID: PMC6988264.
[7] Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 as a target for CAR-T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020 Jan;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 Dec 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.
[8] Hu H, Zhang Z, Wang R, Wang Y, Jin J, Cai L, Yang J, Duan H, Wu Z, Fang Z, Liu B. BGC823 Cell Line with the Stable Expression of iRFP720 Retains Its Primary Properties with Promising Fluorescence Imaging Ability. DNA Cell Biol. 2020 May;39(5):900-908. doi: 10.1089/dna.2019.5057. Epub 2020 Feb 25. PMID: 32096664.
[9] Qiu J , Peng P , Xin M , Wen Z , Chen Z , Lin S , Kuang M , Fu Y , Fang G , Li S , Li C , Mao J , Qin L , Ding Y . ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020 Jun 7;8(11):3147-3163. doi: 10.1039/d0bm00147c. Epub 2020 May 4. PMID: 32363359.
[10] Zhao XY, Jiang Q, Jiang H, Hu LJ, Zhao T, Yu XX, Huang XJ. Expanded clinical-grade membrane-bound IL-21/4-1BBL NK cell products exhibit activity against acute myeloid leukemia in vivo. Eur J Immunol. 2020 Sep;50(9):1374-1385. doi: 10.1002/eji.201948375. Epub 2020 Jun 3. PMID: 32357256.
產(chǎn)品訂購
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貨號 |
名稱 |
產(chǎn)地 |
規(guī)格 |
報價/元 |
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40901ES01 |
Yeasen |
100mg |
1008.00 |
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40901ES02 |
Yeasen |
500mg |
2556.00 |
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40901ES03 |
Yeasen |
1g |
3996.00 |
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40901ES08 |
Yeasen |
5g |
15876.00 |
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40901ES10 |
Yeasen |
10g |
31212.00 |
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40902ES01 |
Yeasen |
100mg |
1000.00 |
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40902ES02 |
Yeasen |
500mg |
2600.00 |
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40902ES03 |
Yeasen |
1g |
3996.00 |
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40902ES08 |
Yeasen |
5g |
14898.00 |
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40903ES01 |
Yeasen |
100mg |
708.00 |
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40903ES02 |
Yeasen |
500mg |
2556.00 |
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40903ES03 |
Yeasen |
1g |
3588.00 |
