Anti-DYKDDDDK（Flag）IP/Co-IP Kit Flag標(biāo)簽蛋白免疫(共)沉淀試劑盒
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產(chǎn)品說(shuō)明書
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Anti-DYKDDDDK（Flag）IP/Co-IP kit (Flag標(biāo)簽蛋白免疫（共）沉淀試劑盒)是一種通過(guò)高質(zhì)量的Anti-Flag免疫磁珠，進(jìn)行Flag標(biāo)簽融合蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的試劑盒。本試劑盒包含高質(zhì)量的Anti-Flag免疫磁珠及經(jīng)過(guò)優(yōu)化驗(yàn)證的免疫沉淀必要試劑，每個(gè)反應(yīng)使用25 uL磁珠，本試劑盒所含試劑足夠完成40個(gè)反應(yīng)。
Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）是一種聚合物磁性微球，由高質(zhì)量的鼠源抗DYKDDDDK (Flag) 單克隆抗體與粒徑為200 nm的硅基磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有快速的磁響應(yīng)性，超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異結(jié)合和豐富的結(jié)合位點(diǎn)等特點(diǎn)，可用于帶有Flag標(biāo)簽的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。
Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）可結(jié)合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。
產(chǎn)品信息
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類別 |
編號(hào) |
組分名稱 |
20765ES40（40T） |
保存方式 |
翌圣貨號(hào) |
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Part Ⅰ |
20765-A |
Lysis Buffer for IP Assays 免疫沉淀用(IP)裂解液 |
100 mL |
-25~-15℃ |
20118ES |
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20765-B |
蛋白酶抑制劑Cocktail,EDTA-free,100×DMSO儲(chǔ)液 |
1 mL |
-25~-15℃ |
20124ES |
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20765-C |
5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 |
1 mL |
-25~-15℃ |
20315ES |
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Part Ⅱ |
20765-D |
Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads |
1 mL |
2~8℃ |
20565ES |
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20765-E |
1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L |
1 L |
RT |
60157ES |
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20765-F |
洗脫緩沖液 |
5 mL |
2~8℃ |
N/A |
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20765-G |
中和緩沖液 |
1 mL |
2~8℃ |
N/A |
儲(chǔ)存條件
Part Ⅰ-25~-15℃保存；Part Ⅱ2~8℃保存；有效期1年。
Part Ⅱ中的Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads，避免冷凍。
使用說(shuō)明
工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)濃度。
1.緩沖液配制
裂解緩沖液：免疫沉淀用(IP)裂解液（20765-A）可解凍后直接使用。
平衡/結(jié)合/洗雜緩沖液：1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L（20765-D）, 使用時(shí)用蒸餾水或超純水溶解，定容至1L即可。
洗脫緩沖液：洗脫緩沖液（20765-F）可直接使用。
中和緩沖液：中和緩沖液（20765-G）可直接使用。
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制：取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)（20765-C）用水稀釋5倍即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。
2.樣品制備
本操作說(shuō)明書提供以下三種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來(lái)源的樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測(cè)蛋白釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上
備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）?；靹蚝笾糜诒咸幚?/font>10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。
貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩遍；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。
3. 磁珠預(yù)處理
3.1用移液器輕柔吹打Anti-Flag免疫磁珠，使其充分混懸，取25 µL 磁珠懸液置于1.5 mL離心管中。
3.2加入500 µL 裂解緩沖液/結(jié)合緩沖液并輕輕移液器混合，用移液器輕柔吹打重懸Anti-Flag免疫磁珠，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。重復(fù)洗2次。
4.樣品的結(jié)合
4.1在預(yù)處理后的磁珠中加入含有Flag標(biāo)簽的蛋白樣品，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育(常溫1~2 h，或4℃過(guò)夜)；
4.2將上述混合液置于磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后，把上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用(上清液可用于檢測(cè)Flag標(biāo)簽蛋白是否存在殘留)，原離心管中剩余的即為蛋白-磁珠復(fù)合物；
注意：結(jié)合過(guò)程中，磁珠可能會(huì)出現(xiàn)聚團(tuán)或呈片狀，屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.洗滌
5.1向上述步驟4.2所得的蛋白-磁珠復(fù)合物中加入1000 µL裂解緩沖液/洗雜緩沖液，輕柔混勻磁珠5~10 min，接著在磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后后, 吸棄上清；
5.2重復(fù)步驟5.1兩次，直至洗滌后的上清液OD280小于0.05為止；
注意：如上清液的OD280仍大于0.05，則適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
6.蛋白洗脫
A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測(cè)。
1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 5min。
2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
B. 非變性洗脫
1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入100 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。
2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。
3) 重復(fù)步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。
注意事項(xiàng)
1.請(qǐng)勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會(huì)導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。
2.本試劑盒提供的Lysis Buffer for IP Assays經(jīng)反復(fù)測(cè)試，適合很多情況下的免疫沉淀或免疫共沉淀時(shí)的樣品裂解和后續(xù)的洗滌。但 IP 實(shí)驗(yàn)中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會(huì)受到 Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優(yōu)化操作細(xì)節(jié)或者篩選及配制緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20241021
