產(chǎn)品簡介

 

Anti-HA IP/Co-IP kit (HA標(biāo)簽蛋白免疫（共）沉淀試劑盒)是一種通過高質(zhì)量的Anti-HA免疫磁珠，進行HA標(biāo)簽融合蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的試劑盒。本試劑盒包含高質(zhì)量的Anti-HA免疫磁珠及經(jīng)過優(yōu)化驗證的免疫沉淀必要試劑，每個反應(yīng)使用25 uL磁珠，本試劑盒所含試劑足夠完成40個反應(yīng)。

Anti-HA免疫磁珠（Anti-HA MagBeads）是一種聚合物磁性微球，由高質(zhì)量的鼠源抗HA單克隆抗體與粒徑為200 nm的硅基磁珠通過共價偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有快速的磁響應(yīng)性，超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異結(jié)合和豐富的結(jié)合位點等特點，可用于帶有HA標(biāo)簽的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

 

產(chǎn)品信息

 

類別	編號	組分名稱	20766ES40（40T）	保存方式	翌圣貨號
Part Ⅰ	20766-A	Lysis Buffer for IP Assays 免疫沉淀用(IP)裂解液	100 mL	-25~-15℃	20118ES
	20766-B	蛋白酶抑制劑Cocktail,EDTA-free,100×DMSO儲液	1 mL	-25~-15℃	20124ES
	20766-C	5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液	1 mL	-25~-15℃	20315ES
Part Ⅱ	20766-D	Anti-HA MagBeads	1 mL	2~8℃	20566ES
	20766-E	1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L	1 L	RT	60157ES
	20766-F	洗脫緩沖液	5 mL	2~8℃	N/A
	20766-G	中和緩沖液	1 mL	2~8℃	N/A

 

儲存條件

 

Part Ⅰ-25~-15℃保存；Part Ⅱ2~8℃保存；有效期1年。

Part Ⅱ中的Anti-HA MagBeads，避免冷凍。

 

使用說明

 

工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實驗確定，建議進行預(yù)實驗摸索最佳實驗濃度。

1.緩沖液配制

裂解緩沖液：免疫沉淀用(IP)裂解液（20766-A）可解凍后直接使用。

平衡/結(jié)合/洗雜緩沖液：1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L（20766-D）, 使用時用蒸餾水或超純水溶解，定容至1L即可。

洗脫緩沖液：洗脫緩沖液（20766-F）可直接使用。

中和緩沖液：中和緩沖液（20766-G）可直接使用。

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制：取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)（20766-C）用水稀釋5倍即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2.樣品制備

本操作說明書提供以下三種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M行預(yù)處理，使待檢測蛋白釋放

至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上

備用(或置于-20℃長期保存)。

懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩遍；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸?；靹蚝笾糜诒咸幚?/font>10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

3.磁珠預(yù)處理 

3.1用移液器輕柔吹打Anti-HA免疫磁珠，使其充分混懸，取25 µL 磁珠懸液置于1.5 mL離心管中。

3.2加入500 µL 裂解緩沖液/結(jié)合緩沖液并輕輕移液器混合，用移液器輕柔吹打重懸Anti-HA免疫磁珠，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。重復(fù)洗2次。

4. 樣品的結(jié)合

4.1在預(yù)處理后的磁珠中加入含有HA標(biāo)簽的蛋白樣品，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育(常溫1~2 h，或4℃過夜)；

4.2將上述混合液置于磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后，把上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用(上清液可用于檢測HA標(biāo)簽蛋白是否存在殘留)，原離心管中剩余的即為蛋白-磁珠復(fù)合物；

注意：結(jié)合過程中，磁珠可能會出現(xiàn)聚團或呈片狀，屬于正?，F(xiàn)象，不會影響實驗結(jié)果。

5. 洗滌

5.1向上述步驟4.2所得的蛋白-磁珠復(fù)合物中加入1000 µL裂解緩沖液/洗雜緩沖液，輕柔混勻磁珠5~10 min，接著在磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后后, 吸棄上清；

5.2重復(fù)步驟5.1兩次，直至洗滌后的上清液OD280小于0.05為止；

注意：如上清液的OD280仍大于0.05，則適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。

6．蛋白洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 5 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入100 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復(fù)步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

 

注意事項

 

1. 請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。

2. 本試劑盒提供的Lysis Buffer for IP Assays經(jīng)反復(fù)測試，適合很多情況下的免疫沉淀或免疫共沉淀時的樣品裂解和后續(xù)的洗滌。但 IP 實驗中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到 Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優(yōu)化操作細(xì)節(jié)或者篩選及配制緩沖液進行實驗。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20241021