產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

泛素化是通過(guò)三個(gè)酶促步驟實(shí)現(xiàn)的。在ATP依賴的過(guò)程中，泛素激活酶(E1)催化與泛素形成活性硫酯鍵，然后轉(zhuǎn)移到泛素載體蛋白的活性位點(diǎn)半胱氨酸(E2)。泛素級(jí)聯(lián)對(duì)特定底物蛋白的選擇性依賴于E2結(jié)合酶(細(xì)胞中包含的相對(duì)較少)和泛素-蛋白連接酶(E3s)之間的相互作用，迄今為止已經(jīng)鑒定出600多種這種酶。E3s是一個(gè)大的，多樣化的蛋白質(zhì)組，其特征是幾個(gè)確定的基序之一。這些包括HECT(與e6相關(guān)蛋白c端同源)，RING或U-box(沒(méi)有Zn2+結(jié)合配體的完整補(bǔ)充的修飾的RING基序)結(jié)構(gòu)域。而HECT E3s在泛素化過(guò)程中具有直接的催化作用，RING和U-box E3s促進(jìn)蛋白質(zhì)泛素化。后兩種E3類型充當(dāng)適配器類分子。它們使E2和底物足夠接近，從而促進(jìn)底物的泛素化。雖然許多RING-type e3，如MDM2和c-Cbl，可以單獨(dú)發(fā)揮作用，但其他一些是作為更大的多蛋白復(fù)合體的組成部分，如后期促進(jìn)復(fù)合體。綜上所述，這些多面的特性和相互作用使E3s能夠利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，在真核生物的所有細(xì)胞中提供一種強(qiáng)大而具體的蛋白質(zhì)清除機(jī)制。E3s的重要性突出體現(xiàn)在其調(diào)節(jié)的正常細(xì)胞過(guò)程的數(shù)量，以及與其功能喪失或靶向不當(dāng)相關(guān)的疾病的數(shù)量.

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

來(lái)源(Source)	E.coli
分子量 (Molecular Weight)	E3酶大約102kDa,底物蛋白大約40.7kDa.
外觀 (Physical Appearance)	Liquid
標(biāo)簽(Tag)	None
純度(Purity)	> 95% by SDS-PAG
緩沖液(Buffer)	(25 µM) in 50 mM HEPES （pH 7.5）, 200 mM NaCl, 10% Glycerol.
濃度（Concentration）	具體見(jiàn)管外標(biāo)簽

 

產(chǎn)品組分

 

組分編號(hào)	組分名稱	規(guī)格
20439-A	重組人泛素連接酶E3	20 μL
20439-B	修飾底物蛋白	20 μL

 

反應(yīng)緩沖液配方

 

名稱	組分	濃度
10 × Reaction Buffer（200 μL）	Tris PH8.0	500 mM
	DTT	6 mM
	ddH2O	to 200 μL
10 x ATP-Mg （200 μL）	ATP	100 mM
	MgCl2	100 mM
	ddH2O	to 200 μL

 

參考陽(yáng)性反應(yīng)體系

 

組分	體積 (μL)
ddH2O	to 20 μL
10 × Reaction Buffer	2 μL
10 × E1 Enzyme	2 μL
5 × Ubiquitin	4 μL
10 × ATP-Mg	2 μL
20 × E2 Enzyme	1 μL
10 × E3 Ligase Itch (Positive control)	2 μL
20 × 底物修飾蛋白 (Positive control)	1 μL

 

反應(yīng)條件

 

37℃孵育（30 min-120min，如果效果不明顯可增加反應(yīng)時(shí)間12 h），建議使用PCR儀或金屬浴。

 

結(jié)果檢測(cè) 

 

1. 取樣品20 μL加入5 μL的5× SDS-PAGE Buffer加入1 μL（1M DTT新鮮配制），加熱樣品95℃ 5 min，隨后使用還原性（含DTT）上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析;
2. 選擇E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate抗體進(jìn)行Western-blot分析。

 

儲(chǔ)存條件

 

-25~-15℃保存，建議第一次使用時(shí)分裝凍存。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 避免反復(fù)凍融。

2. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20241203