Hieff NGS?Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit 兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)以及雙模式mRNA建庫(kù)試劑盒
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)的mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，本試劑盒將cDNA二鏈合成與Endprep、dA-tailing進(jìn)行合并，極大地縮減建庫(kù)時(shí)間。二鏈合成模塊配有兩種Buffer，客戶可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫(kù)或鏈特異性建庫(kù)。本產(chǎn)品適用于起始模板為10 ng-4 μg不同來(lái)源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過(guò)mRNA分離、片段化、雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫(kù)擴(kuò)增，總RNA樣品最終轉(zhuǎn)化為兼容Illumina®和MGI®平臺(tái)測(cè)序的文庫(kù)。
試劑盒包含兩個(gè)獨(dú)立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo (dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性ds-cDNA合成，以及后續(xù)建庫(kù)所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成Buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
產(chǎn)品信息
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貨號(hào) |
12309ES08 / 12309ES24 / 12309ES96 |
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規(guī)格 |
8 T / 24 T / 96 T |
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱(chēng) |
12309ES08 |
12309ES24 |
12309ES96 |
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BOX-I |
12603-A |
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mRNA Capture Beads |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12603-B |
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Beads Binding Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12603-C |
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Beads Wash Buffer |
5 mL |
15 mL |
60 mL |
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12603-D |
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Tris Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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BOX-II |
12309-A |
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Frag/Prime Buffer |
150 μL |
450 μL |
2×900 μL |
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12309-B |
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1st Strand Enzyme Mix |
16 μL |
48 μL |
192 μL |
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12309-C |
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Strand Specificity Reagent |
50 μL |
150 μL |
580 μL |
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12309-D |
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2nd Strand Buffer (dNTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-E |
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2nd Strand Buffer (dUTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-F |
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2nd Strand Enzyme Master Mix |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12309-G |
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Ligation Enhancer |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-H |
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Novel T4 DNA Ligase |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12309-I |
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2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
200 μL |
600 μL |
2×1200 μL |
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12309-* |
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Primer mix |
NA |
NA |
NA |
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注：primer mix為建庫(kù)必須試劑，但該成分不包含在本試劑盒，需要額外配置。本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)，但需要額外配置專(zhuān)屬于Illumina®或者M(jìn)GI®的primer mix(Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®以及Cat# 13334 Primer Mix for MGI®)。 |
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儲(chǔ)存條件
Box I：2-8°C保存、Box II：-25~-15℃保存。有效期1年。
使用說(shuō)明
實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀：
一、關(guān)于接頭連接(Adapter Ligation)
1.本公司可提供Illumina®或者M(jìn)GI®長(zhǎng)接頭(Barcoded Adapter)試劑盒和短接頭試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。
2.我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭，如客戶使用自制接頭，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。
3.使用接頭時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；室溫操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度最好不要超過(guò)25°C，防止接頭解鏈。
4.建庫(kù)過(guò)程中，接頭濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請(qǐng)根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer，稀釋過(guò)的接頭可在4°C保存48 h。
表1-1 Input Total RNA量與Illumina接頭濃度推薦表
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Input Total RNA |
Illumina Adapter stock concentration |
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10 ng |
1 μM |
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100 ng |
1.5 μM |
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500 ng |
3 μM |
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≥1 μg |
5 μM |
表1-2 Input Total RNA量與MGI接頭使用濃度推薦表
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Input Total RNA |
MGI Adapter stock concentration |
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100–499 ng |
2 μM |
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500–4000 ng |
5 μM |
*可根據(jù)不同類(lèi)型Total RNA樣本及投入量，按需求適當(dāng)調(diào)整Adapter使用量
二、關(guān)于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。
2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。
5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。
三、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增 (Library Amplification)
1. 本試劑盒中的文庫(kù)擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進(jìn)行無(wú)偏好性地?cái)U(kuò)增。
2. 文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Input Total RNA量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦。
表2 Input Total RNA 量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*
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Input Total RNA |
Number of cycles |
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Non-stranded |
Stranded |
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10 ng |
15 |
15 |
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100 ng |
14 |
14 |
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500 ng |
12 |
13 |
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1 μg |
11 |
12 |
【注】：*由于文庫(kù)產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量、片段化條件、分選條件等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫(kù)過(guò)程中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫(kù)條件。
四、自備材料 (Other Materials)
1. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。
2. RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。
3. Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效產(chǎn)品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效產(chǎn)品）。
4. 文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。
5. 其他材料：無(wú)水乙醇、無(wú)菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。
五、操作流程
圖1 mRNA建庫(kù)試劑盒流程原理流程圖
