NGS mRNA建庫完全攻略—從mRNA純化到注意事項(xiàng)
mRNA測(cè)序簡(jiǎn)述
RNA高通量測(cè)序（RNA-sequencing,縮寫為RNA-seq）是目前高通量測(cè)序技術(shù)中應(yīng)用廣泛的技術(shù)之一，它可以幫助我們了解各種比較條件下基因表達(dá)情況的差異。在所有差異類型的檢測(cè)中，常見的方法為檢測(cè)mRNA表達(dá)量的差異，而mRNA樣本在上機(jī)測(cè)序之前會(huì)做怎么的處理？它與DNA樣本的建庫處理又有哪些不同？今天小翌跟大家詳細(xì)講解。
mRNA建庫步驟
在上機(jī)測(cè)序之前，提取到的核酸樣本都需要做處理，樣本處理的過程就叫做建庫，我們都知道DNA建庫的本質(zhì)是在核酸片段兩端加上接頭的過程，RNA建庫的本質(zhì)也是如此。RNA建庫由于增加了RNA富集、片段化和反轉(zhuǎn)成雙鏈DNA幾個(gè)步驟顯得比DNA文庫構(gòu)建要繁瑣些，下面我們一起看看 mRNA建庫中的三個(gè)關(guān)鍵步驟：mRNA純化、片段化處理和反轉(zhuǎn)成雙鏈DNA。
首先說到mRNA純化，為什么要做mRNA純化呢，這是因?yàn)橥ǔ３樘岬降目俁NA中，絕大部分都是核糖體RNA（rRNA），如圖1所示：
圖1.人類組織或細(xì)胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖
核糖體RNA占90%以上，mRNA占2%~3%，剩下的為L(zhǎng)ncRNA、tRNA、miRNA等。
如果我們把所有的RNA都拿來測(cè)序，測(cè)到的絕大部分的數(shù)據(jù)都是rRNA，而rRNA在不同組織、器官當(dāng)中的表達(dá)極度穩(wěn)定，也就是說，這樣的數(shù)據(jù)，并不能為實(shí)驗(yàn)者提供有用的信息，所以在很多的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)中都選擇純化mRNA的方法來提高最終測(cè)序數(shù)據(jù)利用率。
那么，該怎樣從總的RNA中，單獨(dú)將我們想要的mRNA純化出來呢 ？
mRNA純化的方法主要包括兩種：poly（A）純化法和去除rRNA法
poly（A）純化法
Poly（A）純化法主要應(yīng)用在真核生物的mRNA純化，大部分真核生物的mRNA結(jié)構(gòu)與原核生物的mRNA結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，真核生物的mRNA的3’端具有poly（A）尾結(jié)構(gòu)，因此可以選用Oligo（dT）磁珠直接進(jìn)行靶向雜交富集（見圖2）；當(dāng)然，也可以通過使用Oligo（dT）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以擴(kuò)增捕獲帶有poly（A）的mRNA，但是引物捕獲由于特異性差和富集度低，因此在實(shí)際操作中還是以磁珠純化的方法較多。
圖2. 利用Oligo（dT）磁珠特異性吸附真核生物mRNA示意圖
注意：利用Oligo dT磁珠對(duì)mRNA進(jìn)行富集和純化時(shí)，在移除上清時(shí)要等磁珠被徹底吸附后（上清澄清）在磁力架上小心進(jìn)行，避免吸到磁珠，以免造成mRNA的損失。加入片段化試劑前，要將Bead Washing Buffer吸干凈，否則會(huì)影響片段化結(jié)果，可以在用大規(guī)格槍移除液體之后再用10 uL的移液槍移除殘留的Washing Buffer（或者直接用200 uL的黃槍頭套著10 uL的白槍頭使用）。
去除rRNA法
針對(duì)類似原核生物中沒有poly（A）結(jié)構(gòu)的mRNA和部分樣品降解的總RNA樣本（如FFPE樣本），無法直接富集，只能通過去除rRNA的方法來達(dá)到富集mRNA的目的。
目前所涉及的去除rRNA方法主要如下：
1. 探針雜交捕獲法（Ribo-Zero-seq）
原理：使用特異性的DNA探針或RNA探針與rRNA雜交，然后利用鏈霉親和素磁珠吸附去除rRNA。
優(yōu)點(diǎn)：高效、特異性好，適用于多種物種的rRNA去除。
缺點(diǎn)：需要根據(jù)研究物種的rRNA序列設(shè)計(jì)特異性的雜交探針。
圖3. 利用探針雜交捕獲法（Ribo-Zero-seq）去除rRNA示意圖
2. RNase H介導(dǎo)的消化法
原理：利用特異性的DNA探針與rRNA雜交，RNase H能夠特異性消化DNA-RNA雜交鏈中的RNA單鏈，而未與探針雜交的mRNA、lncRNA等不受影響，從而富集目標(biāo)RNA。
優(yōu)點(diǎn)：高效、特異性好，適用于多種物種的rRNA去除。
缺點(diǎn)：需要設(shè)計(jì)特異性的DNA探針。
圖4. RNase H介導(dǎo)的消化法去除rRNA示意圖
3. 一步法靶向rRNA快速去除技術(shù)
原理：利用強(qiáng)結(jié)合能力的逆轉(zhuǎn)錄阻礙探針優(yōu)先封閉靶RNA，阻止逆轉(zhuǎn)錄酶通過逆轉(zhuǎn)錄阻礙探針鎖定的靶RNA位點(diǎn)，從而達(dá)到在逆轉(zhuǎn)錄過程中去除靶RNA的目的。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，僅需一步加樣操作，耗時(shí)僅3分鐘，無需額外的純化操作，對(duì)非靶RNA保留完整、特異性強(qiáng)、效率高和基因檢出數(shù)高。
缺點(diǎn)：需要特定的試劑盒。
圖5.一步法靶向rRNA快速去除
4、磁珠法rRNA去除技術(shù)
設(shè)計(jì)特異性的DNA探針，這些探針能夠與需要去除的rRNA特異性雜交。探針通常帶有生物素標(biāo)記，以便與鏈霉親和素磁珠結(jié)合。
優(yōu)點(diǎn)：
-
高效：能夠高效去除rRNA，保留目標(biāo)RNA。
-
特異性高：通過特異性探針設(shè)計(jì)，減少非特異性結(jié)合，提高去除效率。
-
適用范圍廣：適用于多種物種的rRNA去除，包括原核生物和真核生物。
缺點(diǎn)：成本較高
圖6.磁珠法rRNA去除原理圖
mRNA純化之后的文庫構(gòu)建通常有兩種思路，一種是先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進(jìn)行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
1）先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進(jìn)行cDNA的片段化：此方法先得到長(zhǎng)片段的cDNA，反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進(jìn)行片段化（酶切法或機(jī)械法），得到片段化dsDNA之后的建庫方法與DNA建庫方法完全一致。
2）先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應(yīng)立即進(jìn)行一鏈cDNA合成，因?yàn)閙RNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時(shí)需根據(jù)需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時(shí)間。（一般設(shè)置為150-200bp 94°C，15 min；200-300bp 94°C，10 min；250-550 bp 94°C，5 min）
兩種片段化結(jié)果，對(duì)后期的轉(zhuǎn)錄本有不同的偏好性，對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)可參考下圖：
圖7.不同方法建庫對(duì)后期讀數(shù)的偏好性，紅線代表RNA片段化，綠線代表反轉(zhuǎn)為cDNA后片段化
先針對(duì)mRNA進(jìn)行打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得測(cè)序reads主要是針對(duì)基因本體的；若先反轉(zhuǎn)錄，尤其是結(jié)合oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的測(cè)reads對(duì)轉(zhuǎn)錄本3'端具有比較強(qiáng)的偏好性，所以在mRNA-Seq中建議采用先對(duì)mRNA打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的文庫構(gòu)建方法。
在做mRNA測(cè)序文庫構(gòu)建的時(shí)候，一般分為常規(guī)建庫和mRNA鏈特異性建庫。鏈特異性文庫和常規(guī)mRNA文庫的區(qū)別在于合成第二鏈cDNA時(shí)加入的核苷酸種類，如果要構(gòu)建常規(guī)mRNA文庫，則加入dNTP，而如果要構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫則加入dNTP中使用dUTP代替dTTP，這樣合成的第二鏈cDNA含有U堿基，后期再通過識(shí)別U堿基的方法去除第二鏈cDNA，從而達(dá)到構(gòu)建鏈特異性mRNA的效果，具體方法包括：使用特殊酶不擴(kuò)增帶有U堿基的鏈；使用UDG酶去除帶有U堿基的合成鏈。
注意事項(xiàng)
小翌總結(jié)了mRNA建庫中的幾個(gè)小Tips，希望大家在mRNA建庫的時(shí)候可以少走一些彎路：
Tip1：mRNA建庫方法對(duì)RNA的完整度有較高的要求。也就是說，只有在mRNA大部分是完整的狀態(tài)下，才能得到比較好的效果。
Tip2：尤其是選擇磁珠吸附的方法，我們知道磁珠它所吸附的是Poly(A)的那些序列。那么如果mRNA發(fā)生了降解，也就是mRNA斷掉了，那么磁珠所吸附下來的片段，都是那些靠近3'端的那些斷片，而那些5'端的斷片呢，是吸附不下來的。會(huì)在富集過程中被洗脫掉，如圖8所示，那么，接下來的數(shù)據(jù)分析當(dāng)中，就會(huì)發(fā)生一定的數(shù)據(jù)偏差。
圖8. 磁珠吸附正常的mRNA和磁珠吸附降解的mRNA示意圖
如何保證能夠測(cè)到盡可能完整的mRNA序列呢？
建庫之前先對(duì)總RNA進(jìn)行一次質(zhì)量檢測(cè)，一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛細(xì)管電泳儀，對(duì)總RNA樣本進(jìn)行一次電泳質(zhì)檢。Bioanalyzer會(huì)根據(jù)18S和28S這兩個(gè)核糖體RNA的電泳峰是否高、是否尖，來判斷RNA的質(zhì)量，并且會(huì)給出一個(gè)分值。這兩個(gè)峰越高、越尖，也就說明RNA的降解就越少，完整度就越高。相對(duì)應(yīng)的分值也會(huì)越高。反之，打分就會(huì)低。這個(gè)分值就是我們常說的“RIN”值。RIN值最高是10分，最低是0分。推薦大家使用RIN值在8.0以上的RNA進(jìn)行建庫和測(cè)序。
以上就是小翌為大家解析的mRNA建庫的關(guān)鍵步驟，此外，小翌還專程為大家繪制了一幅mRNA建庫的標(biāo)準(zhǔn)流程圖，希望可以幫助大家對(duì)建庫的整套流程有更好的認(rèn)識(shí)。
圖9. mRNA建庫流程圖
翌圣mRNA文庫構(gòu)建解決方案
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