Hieff NGS^® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit V2 是針對 Illumina^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設(shè)計的新一代 PCR Free 版建庫試劑盒。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成，在前一代PCR Free 版建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了DNA片段末端修復(fù)和加A效率，同時改善了接頭連接效率?？蓱?yīng)用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。

產(chǎn)品組分

組分編號		組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
			12196ES08	12196ES24	12196ES96
12196-A		Endprep Buffer 2.0	48 μL	144 μL	576 μL
12196-B		Endprep Enzyme 2.0	32 μL	96 μL	384 μL
12196-C		Ligation Enhancer 2.0	240 μL	720 μL	3×960 μL
12196-D		Rapid T4 DNA Ligase 2.0	40 μL	120 μL	480 μL

運輸與保存方法

冰袋運輸。所有組分-20 °C保存，有效期1年。

 

注意事項

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時對各實驗區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為5ng - 1000 ng Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見應(yīng)用中推薦的Input DNA量。

表1  常見應(yīng)用中推薦Input DNA量

應(yīng)用	樣本類型	推薦Input DNA量
全基因組測序	復(fù)雜基因組	50 ng-1000 ng
靶向捕獲測序	復(fù)雜基因組	10 ng-1000 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	FFPE DNA	50 ng-1000 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	cfDNA/ctDNA	≥5 ng
全基因組測序	微生物基因組	≥5 ng
全基因組測序PCR-free測序	高質(zhì)量DNA	≥50 ng

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時推薦的Input DNA量，當(dāng)Input DNA質(zhì)量較差或需要進(jìn)行片段分選時，應(yīng)適當(dāng)上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進(jìn)行磁珠純化或分選。當(dāng)使用機械法進(jìn)行DNA片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長度分選而直接建庫時，請將DNA稀釋在TE Buffer中進(jìn)行片段化，請勿在滅菌超純水中進(jìn)行。

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation)

1. 針對Illumina^®測序平臺，Yeasen提供了Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®，Set 1~Set 2 （Cat#13519-Cat#13520），試劑盒中的接頭濃度為15 μM。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產(chǎn)量；使用Adapter時根據(jù)Input DNA量用TE Buffer進(jìn)行相應(yīng)稀釋。表2列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的Complete Adapter for Illumina^®稀釋方法。

表2  5 ng-1000 ng Input DNA推薦的Complete Adapter for Illumina^®使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
5 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

四、關(guān)于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，不建議分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長度分選時，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個月。

五、關(guān)于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測。

 

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：根據(jù)需要可選擇Yeasen 官網(wǎng)售賣的Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®， Set 1~Set 2 （Cat#13519-Cat#13520）DNA 文庫構(gòu)建專用配套試劑盒，接頭詳細(xì)介紹信息參考上面注意事項中的第三部分“關(guān)于接頭連接”。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer （10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1  Hieff NGS^® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit ^® V2操作流程

三、操作步驟

3.1 末端修復(fù)/dA尾添加（End Repair/dA-Taling）

該步驟將片段化后的Input DNA末端補平，并進(jìn)行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表3所示反應(yīng)體系。

表3  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Fragmented DNA	x
Endprep Buffer 2.0	6
Endprep Enzyme 2.0	4
ddH2O	Up to 60

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表4所示反應(yīng)程序，進(jìn)行末端修復(fù)/dA尾添加反應(yīng)。

表4  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105 °C	On
30 °C	20 min
72 °C	20 min
4 °C	Hold

3.2 接頭連接 (Adapter Ligation)

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表5中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表5所示反應(yīng)體系。

表5  Adapter Ligation PCR體系

名稱	體積 (μL)
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer 2.0	30*
DNA Adapter	5**
Rapid T4 DNA Ligase 2.0	5

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時后離心使用。

**本公司針對Illumina^®測序平臺的接頭濃度為15 μM。請根據(jù)注意事項三中的提示，對接頭進(jìn)行稀釋，加水補齊，使接頭體積為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表6所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表6  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋	Off
20 °C	15 min
4 °C	Hold

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post-Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行直接純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。直接純化步驟參考3.3.1，分選步驟參考3.3.2。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：

1)如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

【注】：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫。

2)如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

【注】：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表7向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋或移液器吹打10次混勻。

表7  磁珠文庫分選推薦比例

DNA文庫大小（插入片段）	150 - 250 bp	200-300 bp	300-400 bp	400-500 bp
DNA文庫大小	250-350 bp	350-450 bp	450-550 bp	550-650 bp
第一輪體積比（Beads:DNA）	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×
第二輪體積比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads （Cat#12601）說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表7向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量11 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移10 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項五。

HB220928