產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
Hifair® IV Reverse Transcriptase是在Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶，與Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比，其熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受60℃，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄和mRNA文庫構(gòu)建。Hifair® IV Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可擴增長達10 kb的cDNA。
產(chǎn)品組分
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編號 |
組分 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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11112ES92 (10000 U) |
11112ES93 (5×10000 U) |
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11112-A |
5×Hifair® IV Buffer |
250 μL |
1200 μL |
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11112-B |
Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
50 μL |
250 μL |
產(chǎn)品應(yīng)用
全長cDNA文庫構(gòu)建；終點法PCR；實時定量PCR等。
活性定義
以Poly(A) .Oligo(dT)為模板-引物，在37℃，10 min內(nèi)，將1 nmol的dTTP摻入為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。
運輸與保存方法
冰袋運輸。-20ºC保存，有效期一年。
注意事項
1）請保持實驗區(qū)域潔凈；操作時需穿戴干凈的手套、口罩；實驗所用耗材均需保證RNase free，以防止RNase污染；
2）所有操作均應(yīng)在冰上進行，防止發(fā)生RNA降解；
3）為保證逆轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的RNA樣本；
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
5）本產(chǎn)品僅做科研用途！
第一鏈cDNA合成操作步驟
1. RNA變性（此步為可選步驟，RNA變性有助于打開二級結(jié)構(gòu)，可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量。）
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組分 |
使用量 |
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RNase free ddH2O |
to 13 μL |
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Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers(2 μM) |
1 μL |
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or 1 μL |
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or 1 μL |
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模板RNA |
Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:1 pg-500 ng |
65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min。簡短離心收集反應(yīng)液后加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并用移液器輕輕吹打混勻。
2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制
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組分 |
使用量 |
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上一步的反應(yīng)液 |
13 μL |
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5×Hifair® IV Buffer |
4 μL |
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dNTP Mix(10 mM) |
1 μL |
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Hifair® IV Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
1 μL |
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RNase Inhibitor (40 U/µL) |
1 μL |
3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置
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溫度 |
時間 |
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25℃ |
5 min |
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50℃ |
15 min |
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85℃ |
5 min |
【注】：1）當使用Random Primers時，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用50℃。對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到55℃-60℃；
3）85℃加熱5 min，目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。
※ 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
HB221229
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