煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，氧化型輔酶Ⅱ）是細胞中常見的重要輔因子，通過電子交換參與各種代謝反應(yīng)。NAD與一個磷酸分子以酯鍵結(jié)合形成NADP，NADP作為氧化劑參與光合作用。還原性輔酶II (NADPH)是NADP接受電子后的產(chǎn)物。NADPH作為供氫體可參與體內(nèi)多種代謝反應(yīng)，如：脂肪酸和核酸的合成。

該試劑盒適用于測定NADP和NADPH，背景低，靈敏度高。NADPH可以將探針還原為高熒光產(chǎn)物，其信號可以通過熒光酶標(biāo)儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測定(OD =576 nm)中定量。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	組分規(guī)格	儲存條件
50140-A	NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix	1 vial×2	-20℃
50140-B	NADPH Sensor Buffer	20 mL×1	-20℃
50140-C	NADPH Standard	1 vial (167 µg)	-20℃
50140-D	NADPH Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50140-E	NADP Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50140-F	NADP/NADPH Control Solution	10 mL×1	-20℃
50140-G	NADP/NADPH Lysis Buffer	10 mL×1	-20℃

 

運輸和保存方法

冰袋運輸。避光保存于-20℃，有效期1年。

 

注意事項

1 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前請先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。

4 請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。

5 本產(chǎn)品僅用于科研用途。

 

實驗過程

1 試劑準(zhǔn)備

① NADPH標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH Standard（C組分）中制備1 mM NADPH標(biāo)準(zhǔn)品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復(fù)凍融。

② NADPH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(0-10 μM)：將990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH標(biāo)準(zhǔn)母液(1 mM)中制備10 μM NADPH標(biāo)準(zhǔn)液，然后取200 μL的10 μM NADPH標(biāo)準(zhǔn)液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADPH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。

【注】：稀釋后的NADPH標(biāo)準(zhǔn)液不穩(wěn)定，應(yīng)該配置后4 h內(nèi)使用。

③ NADP/NADPH反應(yīng)液：向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADPH Sensor Buffer（B組分），混勻。

【注】：相當(dāng)于125次測試的檢測用量，請根據(jù)實際情況進行調(diào)整。NADP/NADPH反應(yīng)液在室溫下不穩(wěn)定，注意避光盡快使用。

④ NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復(fù)至室溫。

2 樣本制備

2.1 細胞樣本：收集0.5-1×10⁷個細胞，預(yù)冷PBS潤洗后，加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測。

2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預(yù)冷PBS潤洗后，加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.3 細菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細菌，每10⁷個細菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

【注】：建議使用新鮮樣本，如果無法及時進行檢測，樣本建議存于-80 °C，檢測時冰上解凍，但是檢測的熒光值可能會降低。不要使用RIPA裂解液，因為RIPA裂解液會干擾檢測。如果樣本中NADPH含量高，注意稀釋樣本。

3 檢測過程

3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH標(biāo)準(zhǔn)液、待測樣本或空白對照(PBS)。

Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL	BL	TS (Total)	TS (Total)	TS (NADPH)	TS (NADPH)	TS (NADP)	TS (NADP)
NS1	NS1	…	…			…	…
NS2	NS2	…	…			…	…
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution

3.2 對于NADPH提取：向待測樣本中加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E）中和。

3.3 對于NADP提取：向待測樣本中加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D）中和。

3.4 對于總NADP和NADPH：向待測樣本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F）。