煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）是細(xì)胞中常見(jiàn)的重要輔因子，通過(guò)電子交換參與各種代謝反應(yīng)。NADH（還原性輔酶I）是NAD的還原態(tài)。在氧化還原反應(yīng)中，NADH作為氫和電子的供體，NAD作為氫和電子的受體，參與多種生理過(guò)程。NAD/NADH比率可以反應(yīng)細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)。

該試劑盒適用于測(cè)定NAD和NADH，背景低，靈敏度高。NADH可以將探針還原為高熒光產(chǎn)物，其信號(hào)可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測(cè)定(OD =576 nm)中定量。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱(chēng)	組分規(guī)格	儲(chǔ)存條件
50130-A	NAD/NADH Recycling Enzyme Mix	2 vials	-20℃
50130-B	NADH Sensor Buffer	20 mL×1	-20℃
50130-C	NADH Standard	1 vial (142 µg)	-20℃
50130-D	NADH Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50130-E	NAD Extraction Solution	10 mL×1	-20℃
50130-F	NAD/NADH Control Solution	10 mL×1	-20℃
50130-G	NAD/NADH Lysis Buffer	10 mL×1	-20℃

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。避光保存于-20℃，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

1 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前請(qǐng)先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。

4 請(qǐng)勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。

5 本產(chǎn)品僅用于科研用途。

 

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1 試劑準(zhǔn)備

① NADH標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADH Standard（C組分）中制備1 mM NADH標(biāo)準(zhǔn)品母液，用時(shí)置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復(fù)凍融。

② NADH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(0-10 μM)：將970 μL PBS (pH 7.4)加入到30 μL NADH標(biāo)準(zhǔn)母液(1 mM)中制備30 μM NADH標(biāo)準(zhǔn)液，然后取200 μL的30 μM NADH標(biāo)準(zhǔn)液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(10 μM, 3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.0411 μM)。

【注】：稀釋后的NADH標(biāo)準(zhǔn)液不穩(wěn)定，應(yīng)該配置后4 h內(nèi)使用。

③ NAD/NADH反應(yīng)液：向每瓶NAD/NADH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADH Sensor Buffer（B組分），混勻。

【注】：相當(dāng)于96孔板的125次測(cè)試的檢測(cè)用量。NAD/NADH反應(yīng)液不穩(wěn)定，注意避光并盡快使用，未用完的分裝-20°C保存。

④ NAD/NADH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復(fù)至室溫。

2 樣本制備

2.1 細(xì)胞樣本：收集0.5-1×10⁷個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗后，加入100 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測(cè)。

2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗后，加入400 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。

2.3 細(xì)菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細(xì)菌，每10⁷個(gè)細(xì)菌加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。

2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。

【注】：建議使用新鮮樣本，如果無(wú)法及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，樣本建議存于-80 °C，檢測(cè)時(shí)冰上解凍，但是檢測(cè)的熒光值可能會(huì)降低。不要使用RIPA裂解液，因?yàn)镽IPA裂解液會(huì)干擾檢測(cè)。如果樣本中NADH含量高，注意稀釋樣本。

3 檢測(cè)過(guò)程

3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADH標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)樣本或空白對(duì)照(PBS)。

Table 1. Layout of NADH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL	BL	TS (Total)	TS (Total)	TS (NADH)	TS (NADH)	TS (NAD)	TS (NAD)
NS1	NS1	…	…			…	…
NS2	NS2	…	…			…	…
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

NS= NADH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated with NAD/NADH Control Solution , TS (NADH) = test sample treated with NADH Extraction Solution, then neutralized by NAD Extraction, TS (NAD) = test sample treated with NAD Extraction Solution, then neutralized by NADH Extraction Solution

3.3 對(duì)于NAD的提取TS (NAD)：向待測(cè)樣本中加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D）中和。3.2 對(duì)于NADH的提取TS (NADH)：向待測(cè)樣本中加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E）中和。

3.4 對(duì)于總NAD和NADH檢測(cè)TS (Total)：向待測(cè)樣本中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F）。

3.5 對(duì)于NADH標(biāo)準(zhǔn)液NS1-7：向NADH標(biāo)準(zhǔn)液中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，