產(chǎn)品簡介   

酪酰胺信號放大（TSA）系統(tǒng)可用于檢測熒光免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、免疫組織化學(xué)（IHC）和原位雜交（ISH）技術(shù)中的低豐度靶點(diǎn)，可將信號靈敏度提高100倍。TSA熒光試劑盒使用辣根過氧化物酶（HRP）直接催化固定化酶周圍的熒光基團(tuán)共價沉積，該標(biāo)記過程迅速（小于10 min），沉積標(biāo)記可直接在標(biāo)準(zhǔn)或共聚焦顯微鏡下觀察。TSA試劑盒可與傳統(tǒng)染色方法結(jié)合使用用于多色成像，也可以順序進(jìn)行兩個或更多個酪酰胺反應(yīng)以標(biāo)記一個樣品上的不同靶標(biāo)。

TSA技術(shù)可用于酶綴合物和合適的生色底物的明場顯微鏡檢查，也可以與抗熒光素酶結(jié)合物組合使用。與普通實(shí)驗(yàn)相比，使用TSA試劑可顯著提高信號靈敏度，同時保持穩(wěn)定的特異性和分辨率。此外，TSA試劑盒可以顯著減少一抗或探針的消耗量。

Yeasen酪酰胺信號放大（TSA）系列產(chǎn)品包括三款試劑盒：試劑盒60405ES熒光標(biāo)記信號為fluorescein，在激發(fā)和發(fā)射波長494 nm/517 nm下顯微檢測信號；試劑盒60406ES熒光標(biāo)記信號為Cyanine 3，在激發(fā)和發(fā)射波長550 nm/570 nm下顯微檢測信號；試劑盒60407ES熒光標(biāo)記信號為Cyanine 5，在激發(fā)和發(fā)射波長648 nm/667 nm下顯微檢測信號。

本試劑盒可使用100~300 sides。

 

組分信息

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格	儲存條件
		60405ES03（100~300 sides）
60405-A	1X Amplification Diluent	30 mL	2~8℃，避光
60405-B	Fluorescein Tyramide	dry, dissolve in 60 μL DMSO	-25~-15℃，避光
60405-C	Blocking Reagent	6 g	2~8℃，避光

 

儲存條件

1X Amplification Diluent和Blocking Reagent，2~8℃，避光保存，有效期6個月。

Fluorescein Tyramide，粉末狀態(tài)，-25~-15℃保存，有效期6個月。溶于DMSO后，2~8℃，避光保存。

 

使用說明（僅供參考）

一. 自備試劑

(1) 1× PBS（Cat#41403ES）/1×D-PBS（Cat#60152ES）

(2) DMSO（Cat#60313ES）

(3) 多聚甲醛固定液（Cat#60536ES）

(4) Triton X-100（Cat#20107ES）

(5) 改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)（Cat#36319ES）

(6) 30% H₂O₂

(7) 一抗和HRP偶聯(lián)的二抗

(8) 下列試劑僅用于Biotin-Tyramide系列實(shí)驗(yàn)：

a. 生物素封閉清洗緩沖液：含 1% BSA 和 0.05% Tween 20（Cat# 60305ES）的PBS

b. 未標(biāo)記的鏈霉親和素溶液：含 0.1 mg/mL 鏈霉親和素的生物素封閉清洗緩沖液

c. 生物素溶液：含 0.5 mg/mL 生物素的生物素封閉清洗緩沖液。

以下參考步驟，可用于細(xì)胞或組織切片的酪酰胺染色，每個樣品使用100 µL-300 μL 酪酰胺染色液（足以覆蓋96孔板的一個孔或約1 cm²的組織部分），可以根據(jù)不同的樣本尺寸增加或減少酪酰胺染色液的量。

二. 溶液配制

1. 酪酰胺熒光儲存液：組分B溶解于60 μL DMSO，配制成儲存液，儲存液置于2-8℃避光保存。

2. 酪酰胺熒光工作液：每次實(shí)驗(yàn)前，需要用組分A按照1:50-1:500的比例稀釋酪酰胺熒光儲存液，配置成含有0.3%的H₂O₂的酪酰胺熒光工作液（不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模♂尡壤枰M(jìn)行調(diào)整以達(dá)到最優(yōu)的結(jié)果）。每個載玻片大約需要100-300 μL的酪酰胺熒光工作液。

【注】保證配置酪酰胺熒光工作液用到的H₂O₂新鮮有效。每次實(shí)驗(yàn)操作結(jié)束以后，請丟棄未用完的酪酰胺熒光工作液。

3. 封閉緩沖液：可取組分C按照每1g溶于100 mL含0.5% Triton X-100 的PBS中的比例，配置成封閉緩沖液。組分C的用量根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取用，按照上述比例進(jìn)行配置即可。

三、樣本處理

1. 細(xì)胞樣本

(1) 可選：準(zhǔn)備一份陰性對照樣本（不孵育一抗的樣本）。

(2) 1×PBS清洗細(xì)胞兩次。

(3) 細(xì)胞固定：加入適量 4%多聚甲醛固定液（pH 7.4），4℃放置15 min。

(4) 1×PBS清洗細(xì)胞兩次。

(5) 通透細(xì)胞：用配制于PBS中的0.5% TritonX-100 溶液通透，室溫放置10 min?；蛘呒尤氡项A(yù)冷的70%乙醇，在-20℃孵育4 h。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃的條件下保存一周。

(6) 1×PBS清洗細(xì)胞兩次。

2. 石蠟組織切片

(1) 將石蠟切片放置在60℃的烘箱中30 min。

(2) 室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min，以徹底脫蠟。

【注】二甲苯有毒，易揮發(fā)，請?jiān)谕L(fēng)櫥中操作。

(3) 室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

(4) 室溫下，將切片樣本按照順序依次浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂

洗1次，每次5 min。

(5) 室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗1次，每次3 min，再將切片浸沒于1×PBS 中漂洗1次，每次3 min，用濾紙

小心吸干切片樣本周圍多余液體。

(6) 用鉛筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便后續(xù)進(jìn)行通透與標(biāo)記。

(7) 抗原修復(fù)：將改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)用微波爐加熱至沸騰，將脫完蠟及復(fù)水好的片子置于緩沖液中，

間斷煮沸10 min?？乖迯?fù)后取出于室溫中緩慢降溫。

【注】此過程中，玻片上組織要一直浸沒于緩沖液中，以保證組織的抗原修復(fù)效果。不同的樣本選擇不同的抗原修

復(fù)方法。

(8) 1×PBS清洗兩次。

3. 內(nèi)源性過氧化物酶滅活（可選）

加入3%過氧化氫覆蓋樣品并在室溫下孵育60 min，淬滅樣品的內(nèi)源性過氧化物酶活性。

4. 內(nèi)源性生物素阻斷（可選）

進(jìn)行Biotin-tyramide/Streptavidin檢測時，建議阻斷樣品中的內(nèi)源性生物素以減少背景。對于Fluorescein/Cyanine 3/Cyanine 5 -Tyramide的試劑盒來說，可省略此步驟。

(1) 在室溫下，將樣品與未標(biāo)記的鏈霉親和素溶液一起孵育15 min。之后使用生物素封閉清洗緩沖液將樣品在室溫下洗滌3次，每次5 min。

(2) 在室溫下將樣品與生物素溶液孵育30 min，以封閉鏈霉親和素上多余的生物素結(jié)合位點(diǎn)。之后用生物素封閉清洗緩沖液洗滌樣品3次，每次5 min。

5. 免疫標(biāo)記

(1) 封閉：用封閉緩沖液室溫封閉1 h。

(2) 用封閉緩沖液將一抗稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?。將樣品與一抗在室溫下孵育1 h或4℃過夜。

(3) 室溫下1×PBS洗滌3次，每次5 min

(4) 在封閉緩沖液中將HRP偶連的二抗稀釋。用該溶液在室溫下孵育上述樣品1 h。

(5) 室溫下1×PBS洗滌3次，每次5 min。

(6) 每個樣品準(zhǔn)備100 μL-300 μL酪酰胺熒光工作液。染色液在室溫下避光保存，最長可保存24 h。

(7) 將樣品與染色液在室溫下孵育10 min。

(8) 在室溫下用1×PBS洗滌3次，每次5 min。

(9) 可選：如果使用Biotin-tyramide進(jìn)行標(biāo)記，可使用熒光標(biāo)記的Streptavidin進(jìn)行熒光顯色

(10) 顯微鏡成像。對于載玻片上的組織樣本，請蓋上蓋玻片并密封后，再顯微鏡成像。

 

注意事項(xiàng)

1. 不同的熒光試劑盒請按照對應(yīng)建議波長進(jìn)行操作。

2. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒顯示出更高的靈敏度和信號。因此，實(shí)驗(yàn)時一抗的使用濃度較低，可以降低非特異性結(jié)合帶來的背景熒光，我們建議設(shè)置一抗?jié)舛忍荻纫哉业阶罴褲舛取?/font>

3. 如需考慮背景熒光，建議設(shè)置未與一抗孵育的陰性對照。確保該陰性對照在孵育和洗滌過程中沒有被陽性樣品中的試劑交叉污染。對于組織樣品，我們還建議對未染色的對照（不添加抗體或酪酰胺）進(jìn)行成像，以確定組織自發(fā)熒光對背景的影響。

4. 較高的濃度可能會導(dǎo)致信號過強(qiáng)或背景高，可以從1:50到1:500摸索以找到最佳濃度。

5. 可以在每個酪酰胺反應(yīng)后通過進(jìn)行HRP淬滅或抗體剝離，依次使用多個酪酰胺擴(kuò)增試劑盒來標(biāo)記同一樣品上的不同靶標(biāo)。

6. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

7. 本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。