Hieff NGS^® DNA Library Prep Kit是針對Illumina^®和MGI^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的新一代建庫試劑盒。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學組成，在前一代建庫試劑盒的基礎上，改進了DNA片段末端修復和加A效率，同時改善了接頭連接效率。本試劑盒采用新型的高保真酶，顯著提高擴增均一性和保真性，可應用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。

• 適用100 pg-1000 ng所有DNA樣本，包含cfDNA、FFPE等
• 業(yè)界領先的文庫轉(zhuǎn)化率，最高可達70%以上
• 多樣本驗證可獲得優(yōu)異的文庫與測序數(shù)據(jù)
• 嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

 

產(chǎn)品組分

組分編號		組分名稱	13577ES08	13577ES24			13577ES96
13577-A		Endprep Buffer	56 μL		168 μL	672 μL
13577-B		Endprep Enzyme	24 μL		72 μL	288 μL
13577-C		Ligation Enhancer	240 μL		720 μL	3×960 μL
13577-D		Rapid T4 DNA Ligase	80 μL		240 μL	2×480 μL
13577-E		Canace® Pro Amplification Mix	200 μL		600 μL	3×800 μL

 

運輸與保存方法

干冰運輸。-25~-15 °C保存，有效期1年。

 

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為100 pg - 1000 ng Input DNA。應盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應用于常見應用中推薦的Input DNA量。

表1  常見應用中推薦Input DNA量

應用	樣本類型	推薦Input DNA量
全基因組測序	復雜基因組	50 ng-1000 ng
靶向捕獲測序	復雜基因組	10 ng-1000 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	FFPE DNA	50 ng-1000 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	cfDNA/ctDNA	≥500 pg
全基因組測序	微生物基因組	≥1 ng
全基因組測序PCR-free測序	高質(zhì)量DNA	≥50 ng

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時推薦的Input DNA量，當Input DNA質(zhì)量較差或需要進行片段分選時，應適當上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響末端修復/dA尾添加步驟反應效率，建議DNA片段化后進行磁珠純化或分選。當使用機械法進行DNA片段化且產(chǎn)物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請將DNA稀釋在TE Buffer中進行片段化，請勿在滅菌超純水中進行。

三、關于接頭連接（Adapter Ligation)

1. 針對Illumina^®測序平臺，Yeasen提供Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®(Cat#12412~Cat#12413)，試劑盒中的接頭濃度為

15 μM；Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），試劑盒中的接頭濃度為15 μM。

2.針對MGI^® 高通量測序平臺，Yeasen提供了Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；也可搭配Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)雙端UMI UDB短接頭，試劑盒中的接頭濃度為10 μM。

3. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產(chǎn)量；使用Adapter時根據(jù)Input DNA量用TE Buffer進行相應稀釋。

表2列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對Illumina^®測序平臺的Adapter稀釋方法。

表3列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對MGI^®測序平臺的Adapter稀釋方法。

表4列舉了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371）的不同Input DNA量推薦的UMI Adapter稀釋方法。

表5列舉了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)的不同Input DNA量推薦的UMI Adapter稀釋方法。

表2  100 pg-1 μg Input DNA針對Illumina^®測序平臺推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

表3  100 pg-1ug Input DNA針對MGI^®測序平臺推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	100倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	50倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	10倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	2倍稀釋	5 μM

表4  100 pg-1ug Input DNA針對Illumina^®測序平臺推薦的UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

表5  5 ng-1ug Input DNA針對MGI^®測序平臺推薦的UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
5 ng ~ 25 ng	50倍稀釋	0.2 μM
25 ng ~ 100 ng	10倍稀釋	1 μM
100 ng ~ 1000 ng	4倍稀釋	2.5 μM

四、關于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。

2. 當Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個月。

五、關于文庫擴增 (Library Amplification)

1. 是否需要進行文庫擴增取決于Input DNA量、Adapter是否為完整長度、應用需要等因素。如使用非完整長度Adapter，必須進行這一步驟。如使用完整長度Adapter，當Input DNA<200 ng時，推薦進行文庫擴增；當Input DNA≥200 ng或者不需要進行文庫擴增時，可不進行文庫擴增。

2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表6列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數(shù)。

表6  100 pg-1000 ng Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA	1 μg文庫產(chǎn)量推薦PCR循環(huán)數(shù)
1000 ng	2 - 4
500 ng	2 - 4
250 ng	4 - 6
100 ng	5 - 7
50 ng	7 - 9
10 ng	9 - 11
5 ng	10 - 12
1 ng	12 - 15
100 pg	16 - 18

【注】：

1. 表6為使用200 bp左右的高質(zhì)量Input DNA測試的循環(huán)數(shù)參數(shù)。FFPE DNA質(zhì)量差異較大，當DNA質(zhì)量較差或文庫長度較長時，需適當提高循環(huán)數(shù)以獲取足量文庫。
2. 如果建庫過程中需要進行過片段分選，推薦較高循環(huán)數(shù)進行Library Amplification；反之則參照較低循環(huán)數(shù)即可。
3. 如果使用了不完整的接頭，需要擴增至少2個循環(huán)，形成完整的接頭。

六、關于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

 

自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：可選Yeasen 官網(wǎng)的illumina平臺接頭Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers：Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371）DNA 文庫構建專用配套試劑盒，或者可選匹配MGI平臺的接頭：Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362）；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364）；Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)；接頭詳細介紹信息參考上面注意事項中的第三部分“關于接頭連接”。

DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®。

4.其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁

力架、PCR儀等。

 

操作流程

圖1  Hieff NGS^® DNA Library Prep Kit操作流程