產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)溶液，具有熒光強(qiáng)度高，靈敏度高和特異性強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)量高等特點(diǎn)，顏色為藍(lán)色，具有加樣示蹤的作用。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動(dòng)，可以有效抑制樣品準(zhǔn)備過程中引物退火導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增。同時(shí)配方添加了提升PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴(kuò)增的促進(jìn)因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。
儲(chǔ)存條件
-25~-15℃避光保存，有效期18個(gè)月。
使用說明
- 推薦qPCR反應(yīng)體系
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組分 |
體積 （μL）*** |
體積 （μL）*** |
終濃度 |
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Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)* |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA/cDNA** |
x |
x |
- |
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無菌超純水 |
Up to 50 |
Up to 20 |
- |
表1 qPCR反應(yīng)體系
*通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。
**如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10，最佳模板加入量以保證擴(kuò)增得到的Ct值在20-30個(gè)循環(huán)為宜。
***推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性；上機(jī)前需充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
- 反應(yīng)程序
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
95℃ |
2 min |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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退火/延伸* |
60℃ |
30 sec** |
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熔解曲線階段* |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
1 |
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表2 qPCR反應(yīng)程序
*退火溫度和時(shí)間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。
**熒光信號(hào)采集：請勿忘記打開熒光信號(hào)采集，按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置，幾種常見儀器的時(shí)間設(shè)定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
***熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。
適用機(jī)型
ABI：7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio1, 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;
Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0, Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR
引物設(shè)計(jì)指南
- 推薦引物長度25 bp左右。擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。
- 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
- 引物堿基分布均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個(gè)堿基最好為G或C。
- 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。
- 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對。避免引物 3’端有2個(gè)堿基以上的非特異性互補(bǔ)。
- 設(shè)計(jì)完成的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測，只有具備相同擴(kuò)增效率的引物才可用于定量比較分析。
注意事項(xiàng)
- 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
- 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
- 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號(hào)：11141ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
- 若需要電泳，為了獲得清晰的條帶，建議將qPCR產(chǎn)物稀釋20-30倍后進(jìn)行電泳。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
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